论文部分内容阅读
目的：研究正常骨髓间充质干细胞(BMMSC)与骨髓瘤细胞株相互作用过程中,对BMMSC成纤维细胞激活蛋白(FAP)、增殖诱导配体(APRIL)、B细胞激活因子(BAFF)和胰岛素样生长因子(IGF-1)在mRNA表达水平以及对全基因表达谱的影响。
方法：1、RT-PCR方法测定FAP、APRIL、BAFF和IGF-1在共培养前后BMMSC基因表达分3组:1)对照组A:BMMSC单独培养7天(n=9);2)实验组B:BMMSC与U266细胞Transwell非直接接触共培养7、12天(n=9);3)实验组C:BMMSC与RPMI8226细胞Transwell非直接接触共培养7、12天(n=9)。A、B、C组细胞部分收集提取总RNA,Real-TimePCR.法测定BMMSC中FAP、APRIL、BAFF、IGF-1mRNA表达水平,并进行统计学分析比较。
2、BMMSC全基因组表达芯片检测。分为对照组、与骨髓瘤细胞株共培养组,以及共培养后继续培养组。1)对照组:BMMSC单独培养7天(n=3);2)共培养组:BMMSC与骨髓瘤细胞(U266混合RPMl8226细胞)Transwell非直接接触共培养7天(n=3);3)共培养后继续培养组:BMMSC与骨髓瘤细胞(U266混合RPMI8226细胞)Transwell非直接接触共培养7天去除骨髓瘤细胞株后继续在L-DMEM条件下培养7天(n=3)。培养结束后将上述三组BMMSC收集后,全基因组表达芯片检测。通过基因芯片方法比较对照组、共培养组和继续培养组BMMSC基因表达改变,并通过RT-PCR方法进一步证实。
3、A、B、C组细胞成骨分化:将A、B、C组BMMSCs在7天和12天时间点加入成骨细胞诱导液,诱导时间为21天,取BMMSCs分别进行碱性磷酸酶(NAP)和茜素红(ARS)染色以检测BMMSCs的成骨分化能力。
结果：1、倒置显微镜下观察,A、B、C组BMMSC形态均以长梭形为主,呈贴壁生长,BMMSC形态无明显差异。
2、检测BMMSC成骨能力:采用ARS染色及NAP染色方法结果显示:经过成骨诱导21天后,A、B、C组BMMSC均具有成骨分化能力;ARS结果显示:与A组相比,B、C组BMMSC钙结节减少,提示成骨分化能力减弱。
3、Real-time-PCR结果显示:与A组相比,B、C组的FAP、APRIL、BAFF和IGF-1基因表达水平有改变。骨髓瘤细胞(U266和RPMI8226)与BMMSC共培养后,BMMSC的基因表达发生改变,结果如下:
(1)实验组B、C组在7d时间点上APRIL基因mRNA相对拷贝数分别为0.7078±0.1855和0.7978±0.4585,均明显低于对照组A,且P值分别为0.0139和0.005;均P＜0.05。实验组B、C组在12d时间点上APRIL基因mRNA相对拷贝数分别为1.3584±0.7119和1.059±0.8817,与A组相比没有明显改变,P值分别为0.5718和0.1474,均P＞0.05。
(2)实验组B、C组在7d时间点上FAP基因mRNA相对拷贝数分别为1.593±0.9007和1.363±1.107;均明显低于对照组,P值分别为0.0085和0.0082;均P＜0.01。实验组B、C组在12d时间点上FAP基因mRNA相对拷贝数分别为2.101±1.174和1.989±1.702;与A组相比没有明显统计学差异;P值分别为0.9126和0.7477,均P＞0.05。
(3)实验组B、C组在7d时间点上BAFF基因mRNA相对拷贝数分别为2.874±3.514和1.752±1.439;与A组相比,没有统计学差异,P值分别为0.8049和0.2117;均P＞0.05。实验组B、C组在12d时间点上BAFF基因mRNA相对拷贝数分别为4.636±3.622和3.274±2.614;与A组相比,没有统计学差异,P值分别为0.1145和0.4685,均P＞0.05。
(4)实验组B、C组在7d时间点上IGF-1基因同mRNA相对拷贝数分别为1.245±1.231和1.583±1.947;与A组相比,没有统计学差异,P值分别为0.5561和0.8177,均P＞0.05。实验组B、C组在12d时间点上IGF-1基因mRNA相对拷贝数分别为2.435±2.091和2.028±2.010;与A组相比,没有统计学差异,P值分别为0.6217和0.8307,均P＞0.05。
4、基因芯片结果:与对照组相比,共培养组和共培养后继续培养组的BMMSC基因表达谱发生改变。例如:(1)与阴性对照组相比,共培养组(与骨髓瘤细胞株Transwell共培养7天)的BMMSC的FGFR2、MFAP5基因表达降低;而MMP-1和ANGPTL4表达增高。(2)与阴性对照组相比,共培养后继续培养组(Transwell共培养7天后去除共培养体系中的骨髓瘤细胞株再将BMMSC继续在L-DMEM中培养7天)的BMMSC的TGM2、STC1、CCL7、IL-32、MMP-1和ANGPTL4基因表达升高。进一步通过RT-PCR方法支持以上基因芯片的结果。
结论：1、和对照组相比,实验组细胞的生长形态基本一致。
2、和对照组相比,实验组BMMSC的成骨分化能力下降:ARS法检测结果为钙结节减少。该结果提示骨髓瘤细胞抑制BMMSC的成骨分化能力。
3、和对照组相比,实验组BMMSC在7d时间点上其APRIL、FAP基因表达水平下降,并具有统计学意义;在12d时间点上其APRIL和FAP基因表达无明显改变,并无统计学意义。而7d和12dBAFF基因表达呈现部分上升趋势,IGF-1并无上升趋势,但两者改变均无统计学意义;本实验结果提示骨髓瘤细胞与BMMSC相互作用过程中,可能通过改变BMMSC的旁分泌功能,从而影响骨髓瘤的生存、生长。
4、与单独培养组相比,与骨髓瘤细胞株Transwell共培养7天及继续培养组的BMMSC基因表达谱发生改变。
5、在多发性骨髓瘤的发病过程中,骨髓瘤细胞通过与周围微环境中的细胞成份如BMMSC相互作用,诱导微环境出现继发性改变而参与骨髓瘤的发生和发展。