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第一部分PDK1抑制剂GSK2334470单药及联合mTOR抑制剂PP242的抗骨髓瘤作用研究目的:研究PDK1抑制剂GSK-470的抗骨髓瘤作用及其分子机制;通过体内外实验,探讨GSK2334470协同mTOR抑制剂PP242抑制骨髓瘤细胞生长和诱导细胞凋亡的作用和机制。方法:采用MTT法检测GSK2334470和/或PP242对多发性骨髓瘤(multiply myeloma,MM)细胞株和患者原代细胞的生长抑制作用;流式细胞仪AnnexinV/PI双染法检测细胞凋亡;Western blot 检测 Caspase-3/8/9、PARP、PI3K/PDK1/Akt/mTOR通路相关蛋白的表达情况。构建RPMI8226细胞荷瘤小鼠模型,检测GSK2334470和/或PP242对小鼠瘤体生长的影响。结果:1.GSK2334470可以抑制骨髓瘤细胞株及原代MM患者细胞生长,呈浓度依赖性;对正常细胞株无明显毒性作用。2.外源性IL-6和IGF-1不能逆转GSK2334470对骨髓瘤细胞株的杀伤作用。3.GSK2334470可以诱导MM细胞株和原代细胞发生凋亡,Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9 和 PARP 被激活。4.GSK2334470通过抑制PDK1的磷酸化来调节PI3K/Akt/mTOR通路及其下游蛋白。5.GSK2334470可以协同PP242杀伤骨髓瘤细胞株和原代细胞,诱导细胞凋亡。6.PP242通过抑制mTORC2、下调Akt第473位点上丝氨酸的磷酸化来增强GSK2334470的抗骨髓瘤作用,两者联用完全抑制了 Akt和mTORC1/C2的活性。7.GSK2334470、PP242均可抑制MM荷瘤小鼠瘤体的生长,但联合组的抑制作用更明显,差异有统计学意义;联合组瘤体的mTORC1和mTORC2的活性都有明显下降。第二部分PTEN在PDK1抑制剂GSK2334470抗骨髓瘤作用中的重要性研究目的:研究和比较GSK2334470对四种MM细胞株杀伤作用的差异及其与PTEN基因的关系;通过腺病毒或药物改变骨髓瘤细胞中PTEN蛋白的水平来进一步证实PTEN在GSK2334470抗骨髓瘤作用中重要性;研究GSK2334470与蛋白酶体抑制剂MG132的协同抗骨髓瘤作用及其机制。方法:采用MTT法检测生长抑制作用;流式细胞仪Annexin V/PI双染法检测细胞凋亡;PCR和Western blot检测MM细胞株PTEN的本底表达;腺病毒转染使MM细胞株过表达或低表达PTEN;Western blot检测胞浆PTEN、胞核PTEN及PI3K/PDK1/Akt/mTOR通路相关蛋白的表达情况。激光共聚焦检测PTEN蛋白在细胞内的分布。结果:1.GSK2334470对四种骨髓瘤细胞杀伤作用有明显的差异,对ARP-1和MM.1R较敏感;ARP-1、MM.1R凋亡细胞比例也明显高于RPMI8226和OPM-2;与细胞株的PTEN表达呈正相关。2.通过腺病毒转染改变MM细胞株PTEN的表达,可改变GSK2334470的敏感性。3.MG132通过增加细胞中PTEN的表达,调节PI3K/Akt/mTOR通路及其下游蛋白,协同GSK2334470杀伤骨髓瘤细胞,诱导凋亡。4.GSK2334470可以使MM细胞株胞浆中高表达的PTEN向细胞核转移,明确了 GSK2334470抗骨髓瘤作用的其他机制,与MG132协同抗骨髓瘤的分子机制。结论:GSK2334470通过抑制PDK1的磷酸化来调节PI3K/Akt/mTOR通路,诱导骨髓瘤细胞凋亡;mTOR抑制剂PP242通过抑制mTORC2和p-Akt S473的磷酸化协同GSK2334470发挥抗骨髓瘤作用。GSK2334470的敏感性与MM细胞内PTEN的表达水平有关;可通过蛋白酶体抑制剂MG132或腺病毒转染增加细胞内PTEN的表达提高GSK2334470的杀伤作用;同时GSK2334470还可以使高表达的PTEN发生核转移,与MG132发挥协同抗MM作用。提示靶向抑制PDK1及联合mTOR抑制剂或蛋白酶体抑制剂可能是多发性骨髓瘤治疗的新的措施。