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胶质母细胞瘤为恶性程度最高、侵袭能力最强的胶质瘤,肿瘤细胞多向周围脑组织侵袭、迁移,即使采用以手术为主、辅以放射和化学药物治疗的综合疗法,仅能够有限的提高患者的生存质量、延长无进展生存期,尚无法治愈。肿瘤干细胞(cancer stem cells,CSCs)在白血病中最先被发现,随后在乳腺癌、肺癌等上皮肿瘤中也有发现。在恶性胶质瘤中也证实有胶质瘤干细胞(Glioma stem cells,GSCs)的存在。GSCs是一群具有自我更新、无限增殖、多向分化能力的肿瘤细胞,表达着神经干细胞表型,并常常集中存在于肿瘤坏死区周边、微血管周围以及肿瘤边缘发生侵袭的部位。GSCs极有可能参与启动肿瘤的发生、发展、侵袭播散,逃避了化疗药物的杀伤最终导致肿瘤复发。GSCs在肿瘤细胞侵袭迁移中的重要作用也越来越受到国内外的关注。PI3K/Akt/mTOR信号通路在胶质母细胞瘤中高度激活,在GSCs中也发现其高度活化,该通路是调节肿瘤细胞侵袭迁移的重要通路。PI3K通路能够调控粘着斑激酶(Focal Adhesion Kinase,FAK)及细胞骨架相关蛋白的表达及活化,FAK参与并调节粘着斑的形成,是细胞迁移运动的重要调节蛋白。FAK与PI3K结合是其促进细胞迁移的必要条件,且PI3K抑制剂能够呈浓度依赖的方式抑制FAK对细胞迁移的促进作用。PI3K通路的活化还能够促进基质金属蛋白酶(Matrix metal proteinases,MMPs)的表达,而MMPs可以使细胞外基质中绝大部分的多种蛋白组分降解,使肿瘤细胞侵袭的组织学屏障破坏,进而提高肿瘤细胞的侵袭能力。在GSCs的表型维持中,Notch通路活化的作用最为显著。Notch蛋白在果蝇的研究中最先被发现,在脊椎动物中,Notch通路的受体包括Notch1-4四种,其配体包括Delta-like-1、-3、-4及Jagged-1、-2五种。Notch通路的活化指的是Notch受体与配体结合后,经过两次蛋白酶水解生成Notch蛋白的活化形式—胞内域(Notch intraCelluLar domain,NICD),在NICD被释放进入细胞核内后经过一系列反应而活化下游包括HES和HEY在内的靶基因表达,产生相应的生物学效应,常用Hes1作为Notch通路活化的标志。在人脑肿瘤中,Notch通路异常激活,维持着GSCs的自我更新、抑制其分化、促进其增殖。在胰腺癌、食管癌、乳腺癌等肿瘤中均已发现Notch通路活化后能够启动肿瘤细胞的上皮间质转化,因而可以增强其迁移和侵袭能力。其中Notch1在胶质瘤中的表达强度随着病理分级升高而升高,并与患者的生存情况相关。在急性t淋巴细胞白血病、肾透明细胞癌、膀胱癌等肿瘤中均发现notch1通路能够调节pi3k/akt/mtor通路的活性。这就意味着notch1通路可能通过pi3k/akt/mtor通路调节gscs的侵袭迁移。趋化因子受体cxcr4在胶质瘤细胞中表达并与肿瘤级别相关,特异性与其配体sdf-1(又称为基质细胞衍生因子,cxcl12)结合,在恶性胶质瘤细胞的趋化引导迁移中起着极为重要的作用,有研究指出侵袭能力强的人胶质瘤细胞中cxcr4在转录水平及蛋白水平均过表达,而侵袭能力弱的胶质瘤细胞则无cxcr4的过表达。在gscs中,研究发现cxcr4被其配体sdf-1激活后通过激活pi3k/akt/mtor通路来促进肿瘤细胞的侵袭迁移。综上所述,以上研究表明gscs是侵袭能力较强的肿瘤细胞,而notch1信号通路在维持gscs干性中发挥重要的作用,在许多肿瘤的侵袭迁移中也起着十分重要的作用,意味着notch1信号通路在维持gscs的侵袭性上可能也有着不可忽视的作用。我们推测,gscs中高表达的notch1信号通路可以经sdf-1/cxcr4轴介导调节pi3k/akt/mtor信号通路活性,进而增强gscs的侵袭迁移能力。本课题主要研究活化的notch1通路在gscs侵袭迁移中的作用及其潜在机制,研究分为三个部分:1.高级别胶质瘤组织中nestin、notch1、hes1的表达情况。首先对本院手术留取的35例高级别胶质瘤组织标本及12例颞叶癫痫脑组织标本进行免疫组织化学染色,检测标本中nestin、notch1及hes1的表达情况;然后采用免疫荧光染色检测胶质母细胞瘤组织中nestin与notch1、nestin与hes1、nestin与cd31的共表达情况。实验结果显示,在对照脑组织中nestin、notch1及hes1表达呈阴性或是弱阳性,而在高级别胶质瘤组织标本中阳性表达率增高,且多围绕肿瘤微血管分布;nestin阳性细胞围绕cd31+的血管分布,大部分nestin阳性细胞也表现为notch1及hes1阳性。2.notch1通路经pi3k/akt/mtor通路调控gscs的侵袭迁移。从u87及u251细胞系中培养获得胶质瘤细胞球,利用cd133免疫磁珠细胞分离试剂盒获得cd133+胶质瘤细胞,通过免疫荧光染色检测cd133和nestin的表达对其是否为gscs做出鉴定;利用免疫荧光检测gscs中nestin与notch1、hes1与pakt的表达情况;利用携带notch1抑制物的核苷酸序列(shrna-notch1)及γ-分泌酶抑制剂抑制gscs中notch1通路的活性,分为相应的不做处理的空白对照组(control组)、阴性对照核苷酸序列组(shrna-nc组)、shrna-notch1组以及不做处理的空白对照组(control组)、加入pbs的阴性对照组(药物溶媒组)及dapt组;pcr和westernblot实验检测相应处理组中notch1mrna和蛋白及hes1、akt、pakt、pmtor蛋白表达情况,transwell侵袭和迁移实验分别检测各组细胞的侵袭和迁移能力。实验结果显示:免疫荧光实验结果显示由u87及u251细胞通过无血清培养及免疫磁珠分选出的细胞球均阳性表达gscs标记物cd133和nestin,可以鉴定为gscs(u87)、gscs(u251);在gscs中nestin与notch1存在共表达,hes1与pakt也存在共表达;与对照组比较,抑制notch1通路的活性后,gscs的侵袭迁移能力明显下降,akt蛋白水平没有明显变化,而pakt、pmtor蛋白表达明显降低。3.notch1信号通路经sdf-1/cxcr4轴介导调节pi3k/akt/mtor信号通路活性调控gscs的侵袭迁移。利用免疫荧光检测gscs中hes1与cxcr4的表达情况;在gscs及notch1稳定低表达的gscs中加入cxcr4特异性抑制剂amd3100。实验分为shrna-notch1组、dapt组、amd3100组、shrna-notch1+amd3100组、shrna-nc组、药物溶媒组及control组。transwell侵袭和迁移实验分别检测各组细胞的侵袭和迁移能力,westernblot实验检测相应处理组中notch1、hes1、sdf-1、cxcr4、akt、pakt、pmtor蛋白表达情况。实验结果显示:在gscs中,hes1与cxcr4存在共表达;与对照组相比,notch1通路抑制后,sdf-1蛋白表达水平无明显变化而cxcr4蛋白表达显著降低;与对照组相比,shrna-notch1组、dapt组、amd3100组、shrna-notch1+amd3100组四组的侵袭迁移能力均明显降低,且四组间的侵袭迁移能力降低水平无明显差异;与对照组相比,在shrna-notch1组、dapt组、amd3100组、shrna-notch1+amd3100组中akt蛋白水平无明显变化,而pakt及pmtor蛋白水平显著降低,且四组的降低水平无明显差异。结论:1.与对照脑组织比较,nestin、notch1及hes1在高级别胶质瘤组织标本中阳性表达率增高,且多围绕微血管分布;nestin阳性细胞围绕cd31+的血管分布,大部分nestin阳性细胞也表现为notch1及hes1阳性。2.Notch1通路能够调节GSCs的侵袭迁移能力,并且是通过调节Akt的磷酸化,进而调控其下游信号实现的。3.Notch1通路能够通过SDF-1/CXCR4轴调控PI3K/Akt/mTOR信号通路活性,进而调控GSCs的侵袭迁移能力。