肺癌的发病率和死亡率在我国一直位居首位,并呈逐年增多的趋势,若能早期诊断并及时治疗,90～95%的肺癌是可以治愈的,因此肺癌的早期诊断是提高肺癌治愈率最有效的方法。肿瘤标志物作为肿瘤早期诊断的一种无创性检测,在肿瘤普查、诊断、判断预后、评价疗效和高危人群随访观察等方面都具有较大的实用价值。近年来,随着生物技术(包括蛋白质组、ELISA、RT-PCR、FISH和SELDI-TOF等)的飞速发展,发现了许多有应用前景的肿瘤标志物,但目前无任何一种标志物可准确诊断肺癌和预测预后,多肿瘤标志物联合诊断是提高肺癌诊断准确率的可行策略之一。寻找特异度和灵敏度高的肿瘤标志物联合检测成为目前的研究热点。脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶(APE1)是碱基切除修复(BER)途径中的一个限速酶,具有DNA损伤修复和氧化还原等多种功能,参与多种与细胞重要功能有关的反应,其功能异常可能导致肿瘤形成。研究表明,APE1基因表达具有器官和组织特异性,在肺癌组织中APE1表达水平较正常组织显著升高,且有明显的易位表达。APE1表达定位的改变及表达强度的变化可能是细胞表型异常的决定因素。由于肿瘤细胞增殖过快,不断有细胞发生凋亡和坏死,使细胞内大量蛋白质释放入血,血清中APE1蛋白含量可能升高。理论上,APE1表达水平和定位的改变会刺激机体产生抗APE1的自身抗体。目前认为血清抗体的产生是机体对肿瘤产生的一种特异性的免疫反应,间接反映了肿瘤的发展和演变。对APE1进行血清学检测可能有助于肿瘤的临床诊断,目前对APE1的检测大都为免疫组化或免疫印迹,其定位研究较为透彻,血清学检测在国内外尚未见报道。本研究首先制备兔抗人APE1多克隆抗体,然后建立改良的双抗体夹心ELISA和间接ELISA,检测血清APE1蛋白和抗体的表达,并探讨其与多肿瘤标志物联合检测在肺癌中的诊断作用及其临床应用价值。研究目的1.制备兔抗人APE1多克隆抗体,特异性亲和纯化并对其生物学特性进行鉴定;2.建立双抗体夹心ELISA检测血清中APE1蛋白并结合蛋白芯片检测结果探讨其在肺癌诊断中的作用;3.建立间接ELISA检测血清中APE1抗体并结合蛋白芯片检测结果探讨其临床应用价值。研究内容和方法1.兔抗人APE1多克隆抗血清的制备用纯化的全长APE1蛋白免疫新西兰大白兔,采用一种快速免疫法制备APE1多克隆抗体,ELISA追踪检测抗体效价,Protein A亲和层析法纯化特异性IgG抗体,Western blot和免疫组化检测抗体的特性,为进一步建立双抗体夹心ELISA提供抗体。2.改良的双抗体夹心ELISA检测血清APE1蛋白方法的建立以鼠抗人APE1单克隆抗体包被高亲和力酶标板,APE1全长蛋白为标准品,兔抗人APE1多克隆抗体为检测抗体,HRP标记羊抗兔IgG为酶标抗体建立双抗体夹心ELISA,棋盘滴定法确定各抗体的最佳工作浓度并对ELISA方法的灵敏度、特异度和稳定性进行检测。采用所建立的ELISA方法检测肺癌患者和健康体检者血清并结合蛋白芯片检测结果进行统计学分析,探讨其临床意义。3.间接ELISA检测血清APE1抗体方法的建立以全长APE1蛋白包被高结合力酶标板,HRP标记羊抗人IgG为酶标抗体建立间接ELISA。采用所建立的ELISA方法检测肺癌患者和健康体检者血清并结合蛋白芯片检测结果进行统计学分析,从不同角度探讨其临床应用价值。研究结果1.成功制备了兔抗人APE1多克隆抗体。ELISA检测显示该抗体的效价达到1:128000,相对亲和力常数为8.96×10-6mol/L。Western blot和免疫组化显示该抗体能与APE1蛋白特异性结合。此外,该抗体还可用于小鼠和大鼠组织APE1蛋白的检测。2.建立的夹心ELISA检测APE1蛋白的线性范围为8.0～200 ng/mL;批内变异系数为8.37%～8.97%,批间变异系数为10.47%～14.57%;平均回收率为90.83%。血清中APE1蛋白含量呈偏态分布,健康体检者和肺癌患者血清APE1含量95%可信区间分别为3.67ng/mL～16.58ng/mL和7.06ng/mL～24.90ng/mL,肺癌患者血清APE1蛋白水平明显高于健康体检者(P<0.05)。3.回顾性分析发现,CEA、CA125和CA242三项标志物对肺癌诊断的灵敏度和准确率较高。APE1与这三项指标联合检测对肺癌诊断的灵敏度为68.57%,特异度为80.00%,准确率为74.15%。联合APE1检测较单一标志物检测的诊断灵敏度和准确率都有所提高,但是同时也降低了诊断的特异度。4.建立的间接ELISA在血清稀释度为1:3200时仍能检测的到。批内变异系数平均为8.52%,批间变异系数平均为9.09%。肺癌患者血清APE1抗体水平明显高于健康体检者(P<0.05),APE1抗体阳性率分别为34.49%和3.43%,二者有显著性差异(P<0.05);但APE1抗体在不同性别,不同吸烟状态,不同TNM分期和不同组织病理学分型上并无显著性差异(P>0.05)。5. APE1抗体还与治疗疗效紧密相关,化疗后APE1抗体水平显著高于治疗前;治疗有应答者(CR+PR)血清APE1抗体在化疗后比化疗前显著升高(P<0.05),而无应答者(SD+PD)血清APE1抗体水平在化疗前后没有显著性差别(P>0.05),提示血清APE1抗体可能对预测肺癌的化疗敏感性有重要参考价值。6.血清APE1抗体与肺癌血清检测常用的肿瘤标志物CEA、CA125、和CA242联合检测的诊断灵敏度、特异度和准确率分别为71.17%、95.57%和84.03%。结论1.成功制备了兔抗人APE1多克隆抗体并进行了特异性亲和纯化,抗体效价和纯度均很高;Western blot和免疫组化显示此抗体特异性良好,可满足实验要求。2.首次成功建立了改良的双抗体夹心ELISA检测APE1蛋白,所建立的ELISA方法的灵敏度、特异度、精确度、批内批间差异和稳定性均满足实验要求。3.健康体检者和肺癌患者血清中均能检测到APE1蛋白,但表达量不同,肺癌患者血清APE1蛋白明显高于健康体检者;APE1与CEA、CA125、和CA242联合检测能提高诊断的准确率,提示APE1有望成为一种新的肿瘤标志物。4.首次成功建立了间接ELISA检测血清APE1抗体,肺癌患者血清APE1抗体水平明显高于健康体检者,但APE1抗体在不同性别、吸烟状态、TNM分期和组织病理学分型上并无显著性差异。5.血清APE1抗体还与治疗疗效紧密相关,血清APE1抗体可能对预测肺癌的化疗敏感性有重要参考价值。6.血清APE1抗体与肺癌血清检测常用的肿瘤标志物CEA、CA125、和CA242联合检测可提高诊断的灵敏度和准确率。APE1抗体有可能成为肺癌辅助诊断的指标之一。