目的探讨蛇毒cystatin 在Bac-to-Bac 杆状病毒表达系统中的表达。方法根据中华眼镜蛇蛇毒cystatin 蛋白的氨基酸序列合成cystatin 基因的四个片段,通过缓慢退火PCR 的方法将其拼接为完整的cystatin 基因,PCR 扩增蛇毒cystatin 基因,将其克隆到供体质粒pFastBacHTc 中,通过转化DH10Bac 菌筛选、鉴定并抽提获取高纯度的重组穿梭载体Bacmid-cystatin,经脂质体介导将重组穿梭载体转染Sf9 细胞,获取并扩增重组病毒,空斑分析确定病毒滴度,Western-blot分析适宜的重组融合蛋白表达时间和MOI 值,SDS-PAGE 分析细胞总蛋白,Western-blot 鉴定重组融合蛋白。结果1 构建了携带蛇毒cystatin基因片段的重组供体质粒pFastBacHTc -cystatin,经双酶切鉴定和序列分析证实蛇毒cystatin 基因已正确插入供体质粒的多克隆位点。2 构建了携带蛇毒cystatin 基因片段的重组穿梭载体Bacmid-cystatin,经PCR 鉴定分析证实蛇毒cystatin 基因已正确转座插入穿梭载体的转座接触位点。3 确定了重组融合蛋白在Sf9 细胞中表达的最佳时间是感染后96 h,适宜的MOI 值为10。该重组融合蛋白经SDS-PAGE、Western-blot 分析鉴定为蛇毒6×His-cystatin 融合蛋白,分子量为15000 道尔顿,与融合蛋白的理论分子量相