【研究背景及目的】大多数慢性肝病遵循一个共同的病理过程:即肝脏炎症、肝纤维化、肝硬化。现在已经明确,该过程中肝纤维化是可逆的,因此治疗肝纤维化即可阻断绝大多数慢性肝病向肝硬化发展。目前大多数研究表明在肝纤维化发生过程中最重要的肝脏细胞是活化的肝星状细胞(Hepatic stellate cells,HSCs),因此,传统观念认为逆转肝纤维化的关键在于抑制HSCs的增殖与活化。近年来随着对HSCs的深入研究,发现该细胞具有促进肝前体细胞分化及肝细胞再生,且可以分化为肝细胞和胆管细胞等重要作用,表明HSCs在肝损伤时也具有促进肝脏再生的功能。因此,单纯通过HSCs治疗肝纤维化存在一定的局限性。肝纤维化是由肝脏多种细胞共同调控所致,已有证据表明肝细胞凋亡可诱导HSCs活化从而导致肝纤维化的发生。也有研究表明肝细胞可能通过上皮细胞间质转化(Epithelial mesenchymal transition,EMT)成为肌成纤维细胞从而参与肝纤维化的发生与发展。肝细胞核因子家族,主要包括HNF1、HNF3、HNF4、HNF6以及CCAAT/增强子结合蛋白,这一类转录因子主要在肝脏富集表达,相互调控形成了一个复杂的转录调节网,并参与肝脏分化、发育以及维持成熟肝细胞正常功能。我们既往研究表明HNF1α和HNF4α均可以明显抑制HSCs活化,其中HNF4α可抑制肝细胞和HSCs EMT过程,保护肝脏功能,而HNF1α可通过调节酪氨酸磷酸酶SHIP-1抑制肝脏炎症改善肝纤维化。转录因子FOXA2,又名HNF3β,属于Forkhead转录因子超家族,主要表达于肝脏、肺脏、胰腺和胃肠道,与HNF1α和HNF4α功能相似,可调节肝脏众多肝细胞特异性基因,参与肝脏的发育、代谢以及功能维持。近年来许多研究结果表明在多种肝脏疾病中FOXA2表达下调,并且参与调控肝脏炎症因子的表达。但FOXA2在肝纤维化的发生发展过程中的作用尚未见相关报道。基于肝纤维化在治疗慢性肝病中的重要地位,在本研究中我们首先通过检测人肝硬化组织中FOXA2的表达水平,以及CCl4模型小鼠不同程度肝纤维化的肝组织、肝细胞和HSCs中FOXA2表达变化,探索FOXA2表达与肝纤维化的相关性;利用不同载体上调肝脏、肝细胞和HSCs的FOXA2表达水平,检测对肝纤维化的作用;利用特异性敲除肝细胞FOXA2小鼠观察对肝纤维化的影响;最后通过基因芯片筛选差异基因,明确FOXA2对肝细胞基因表达谱的影响,初步阐述调控肝细胞FOXA2表达影响肝纤维化的分子机制,为临床治疗肝纤维化提供新的靶点和思路。【研究方法】一、检测FOXA2在肝纤维化中的表达特点1、利用免疫组织化学法检测正常人和肝硬化患者肝组织中FOXA2表达差异。2、利用Real-time RT-PCR、Western blot和免疫组织化学法检测CCl4模型不同时间点小鼠肝脏FOXA2表达变化。3、利用Real-time RT-PCR和Western blot法检测正常小鼠与CCl4模型小鼠肝细胞中FOXA2表达差异。4、利用Real-time RT-PCR和Western blot法检测CCl4模型不同时间点小鼠HSCs中FOXA2表达变化。二、上调肝脏FOXA2表达对肝纤维化的作用1、通过慢病毒过表达载体p CDH-CMV-MCS-EF1-cop GFP构建FOXA2过表达质粒p CDH-FOXA2,利用包装质粒ps PAX2和p MD2.G包装慢病毒LV-FOXA2,鉴定后通过尾静脉注射至CCl4模型小鼠。2、利用Real-time RT-PCR、Western blot和免疫组化法检测FOXA2组小鼠与对照组中FOXA2、Collagen I和α-SMA的表达变化。3、使用H&E和天狼星红染色法评估各组小鼠肝脏病理学变化,并使用软件进行胶原定量。4、利用羟脯氨酸试剂盒检测各组小鼠肝脏中羟脯氨酸含量。5、利用Real-time RT-PCR法检测各组小鼠肝组织炎症指标IL-6、TNF-α和TGF-β1的表达变化。三、上调肝细胞FOXA2表达对肝纤维化的影响1、通过腺相关病毒载体p ENN.AAV.TBG.PI.RBG构建可特异性上调肝细胞的FOXA2过表达质粒p AAV8-TBG-FOXA2,包装为腺相关病毒后,通过尾静脉注射至CCl4模型小鼠。2、经尾静脉分别注射AAV8-TBG-FOXA2和对照病毒至正常小鼠,分离小鼠原代肝细胞和其他细胞,利用Real-time RT-PCR和Western blot法鉴定腺相关病毒AAV8-TBG-FOXA2的特异性。3、利用Real-time RT-PCR、Western blot和免疫组化法检测FOXA2组小鼠与对照组中FOXA2、Collagen I和α-SMA的表达变化。4、使用H&E和天狼星红染色法评估各组小鼠肝脏病理学变化,并使用软件进行胶原定量。5、利用羟脯氨酸试剂盒检测各组小鼠肝脏中羟脯氨酸含量。6、利用Real-time RT-PCR和免疫组织化学法法检测各组小鼠肝组织炎症指标IL-6、TNF-α和TGF-β1的表达变化。四、敲除肝细胞FOXA2表达对肝纤维化的影响1、通过对FOXA2lox P小鼠进行杂交、繁殖并鉴定出纯合子FOXA2lox P/lox P小鼠,利用AAV-TBG-Cre特异性敲除肝细胞FOXA2,并进行CCl4造模。2、利用Real-time RT-PCR、Western blot和免疫组化法检测FOXA2敲除组小鼠与对照组中FOXA2、Collagen I和α-SMA的表达变化。3、使用H&E和天狼星红染色法评估各组小鼠肝脏病理学变化,并利用软件进行胶原定量。4、利用羟脯氨酸试剂盒检测各组小鼠肝脏中羟脯氨酸含量。五、上调HSCs中FOXA2表达对肝纤维化的作用1、通过慢病毒载体p LVX-GFAP-IRES-Zs Green构建可特异性上调星状细胞的FOXA2过表达质粒p LVX-GFAP-FOXA2,包装为慢病毒并浓缩纯化后,通过尾静脉注射至正常小鼠,一周后注射CCl4复制肝纤维化模型。2、分离已注射慢病毒LVX-GFAP-FOXA2的正常小鼠的原代肝细胞和HSCs,利用Real-time RT-PCR法鉴定慢病毒LVX-GFAP-FOXA2的特异性。3、利用Real-time RT-PCR、Western blot和免疫荧光法检测FOXA2组小鼠与对照组中FOXA2、Collagen I和α-SMA的表达变化。4、使用H&E和天狼星红染色法评估各组小鼠肝脏病理学变化。六、上调肝细胞FOXA2表达对CCl4模型小鼠肝细胞表达谱的影响1、利用可特异性上调肝细胞FOXA2的腺相关病毒AAV8-TBG-FOXA2经尾静脉注射至CCl4模型小鼠,分离小鼠原代肝细胞后抽提细胞总RNA,鉴定后进行基因芯片杂交实验。2、利用DAVID Online Tools Suite网站工具,查询The Gene Ontology(GO)、KEGG、BIOCARTA、BBID等数据库,获取基因功能分类信息及归属信号转导通路信息。七、统计学处理 数据以X±SD表示,用SPSS 18.0统计软件进行统计学分析。P<0.05有显著差异,P<0.01有非常显著差异。【研究结果】一、FOXA2表达与肝纤维化进程成负相关1、免疫组织化学结果显示,人肝硬化组织较正常肝组织中FOXA2表达明显下降(P<0.01);在CCl4模型小鼠肝纤维化进展过程中,肝脏FOXA2表达逐渐下降。2、Real-time RT-PCR和Western blot结果提示:CCl4模型小鼠肝组织中FOXA2表达较正常小鼠明显下降,且肝细胞FOXA2表达较正常小鼠显著下降(P<0.01),而HSCs中FOXA2表达较正常小鼠显著升高(P<0.01)。二、非特异性上调肝脏FOXA2可改善肝纤维化1、分离小鼠原代肝细胞,体外经LV-FOXA2感染后,Real-time RT-PCR和Western blot结果提示FOXA2表达显著升高,表明慢病毒构建成功。2、在小鼠CCl4模型中,上调肝脏FOXA2表达对小鼠体重无明显影响(22.782±0.6585 vs 22.290±1.2478,P>0.05),但可以显著提高小鼠肝重(1.350±0.2090vs 1.894±0.3868,P<0.05)和肝重体重比(0.059±0.0095 vs 0.084±0.0134,P<0.01)。3、在小鼠CCl4模型中,非特异性上调肝脏FOXA2表达可降低小鼠肝脏Collagen I和α-SMA的表达。4、天狼星红染色结果提示:上调肝脏FOXA2可减少肝脏胶原沉积(P<0.01)。5、羟脯氨酸试剂盒检测结果提示:非特异性过表达肝脏FOXA2可减少肝脏羟脯氨酸含量(376.810±47.5108 vs 249.926±42.9257,P<0.01)。6、Real-time RT-PCR结果提示:上调肝脏FOXA2表达可明显减少TGF-β1的表达,而IL-6和TNF-α表达无明显差异。三、特异性上调肝细胞FOXA2可改善肝纤维化1、Real-time RT-PCR和Western blot结果提示:AAV8-TBG-FOXA2可提高小鼠原代肝细胞FOXA2表达,对其他细胞无明显影响。2、在小鼠CCl4模型中,特异性上调肝细胞FOXA2可显著提高小鼠体重(20.828±0.9264 vs 22.647±0.5900,P<0.01)、肝重(1.072±0.0987 vs 1.382±0.1724,P<0.01)和肝重体重比(0.051±0.0035 vs 0.061±0.0080,P<0.05)。3、Real-time RT-PCR和Western blot结果提示:特异性上调CCl4模型小鼠肝细胞FOXA2表达,可减少肝脏Collagen I和α-SMA的表达。4、天狼星红染色结果提示:上调肝细胞FOXA2表达可显著减少CCl4模型小鼠肝脏胶原沉积(Control组vs FOXA2组=1.832±0.3559 vs 1.126±0.2511,P<0.001)。5、羟脯氨酸检测结果提示:上调肝细胞FOXA2表达可明显减少CCl4模型小鼠肝脏羟脯氨酸含量(Control组vs FOXA2组=547.800±85.8522 vs 354.125±155.384,P<0.05)。6、Real-time RT-PCR和免疫组织化学结果提示:上调肝细胞FOXA2表达可明显减少IL-6、TNF-α和TGF-β1的表达。四、特异性敲除肝细胞FOXA2可促进肝纤维化1、在小鼠CCl4模型中,特异性敲除肝细胞FOXA2表达可减轻小鼠体重(25.610±2.1738 vs 22.391±3.2161),但无统计学差异(P=0.07);可以显著减少小鼠肝重(1.587±0.3028 vs 1.182±0.2307,P<0.05)和肝重体重比(0.061±0.0068 vs0.053±0.0055,P<0.05)。2、Real-time RT-PCR结果提示:FOXA2H-KO+CCl4组在m RNA水平较对照组表达降低约88%(P<0.01),Collagen I表达升高1.97倍(P<0.01),α-SMA表达升高3.65倍(P<0.01);Western blot结果提示:在蛋白水平可见FOXA2H-KO+CCl4组中FOXA2表达水平明显下降,而Collagen I及α-SMA表达显著升高。3、H&E染色结果显示:FOXA2H-KO+CCl4组结缔组织条索较FOXA2lox P/lox P+CCl4组明显增加;天狼星红染色显示:FOXA2H-KO+CCl4组胶原沉积较FOXA2lox P/lox P+CCl4组明显增多(P<0.01)。4、免疫组织化学法结果显示:FOXA2H-KO+CCl4组肝组织基本无FOXA2表达;FOXA2H-KO+CCl4组α-SMA表达较FOXA2lox P/lox P+CCl4组明显增加。5、羟脯氨酸含量分析结果显示:FOXA2lox P/lox P+CCl4组vs FOXA2H-KO+CCl4组=126.634±19.6342 vs 185.516±28.7116(P<0.01)。五、特异性上调星状细胞FOXA2对肝纤维化无影响1、Real-time RT-PCR结果提示:慢病毒LVX-GFAP-FOXA2可上调HSCs中FOXA2表达,对肝细胞FOXA2表达影响无统计学差异,且对正常小鼠HSCs中α-SMA表达无明显影响。2、在CCl4模型小鼠中,上调HSCs的FOXA2表达对小鼠体重、肝重及肝重体重比影响无统计学差异(P>0.05)。3、Real-time RT-PCR和Western blot结果提示:上调HSCs中FOXA2表达可促进CCl4模型小鼠肝脏Collagen I和α-SMA表达,但无统计学差异(P>0.05)。4、天狼星红染色和H&E染色结果提示:特异性上调HSCs中FOXA2对CCl4模型小鼠肝脏病理学无明显影响。5、免疫荧光结果提示:上调HSCs中FOXA2表达对CCl4模型小鼠肝脏α-SMA表达无明显影响。六、上调肝细胞FOXA2表达影响CCl4模型小鼠肝细胞基因表达1、琼脂糖凝胶电泳结果提示送检样品质量合格。2、通过对基因芯片结果进行筛选,在control组vs Normal组的差异基因中,上调的基因3219个,下调基因713个;FOXA2组vs control组的差异基因中,上调基因282个,下调基因279个。3、通过KEGG分析,与肝纤维化相关的通路包括:MAPK信号通路(15个差异基因)、PI3K-AKT信号通路(7个差异基因)、细胞粘附分子(7个差异基因)、凋亡(5个差异基因)、p53信号通路(4个差异基因)、NF-κB信号通路(4个差异基因)、VEGF信号通路(2个差异基因)、TNF信号通路(2个差异基因)、TGFβ信号通路(2个差异基因)、Erb B信号通路(2个差异基因)、Hedgehog信号通路(1个差异基因),JAK-STAT信号通路(1个差异基因)。【结论】1、FOXA2在肝纤维化组织及肝细胞中表达下调,而在HSCs中表达上调。2、过表达肝脏FOXA2可改善小鼠肝纤维化。3、特异性敲除肝细胞FOXA2可加重小鼠肝纤维化,而特异性上调肝细胞FOXA2表达可显著减轻肝纤维化。但上调HSCs中FOXA2表达对肝纤维化无明显作用。4、肝细胞FOXA2表达水平可影响肝纤维化进程,肝细胞是治疗肝纤维化的重要靶点。