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第一部分急性重症胰腺炎脑损伤大鼠模型的建立及相关指标的表达目的:本部分通过建立具备重复性好、容易复制的急性重症胰腺炎(SAP)并发脑损伤大鼠模型,观察重症急性胰腺炎(SAP)时胰腺与脑组织的病理、脑干湿重比(W/D)与体内淀粉酶(AMY)、脂肪酶(LIPA)、炎性介质白细胞介素6(IL-6)和Toll样受体4(TLR4)的变化情况,初步探讨急性胰腺炎时胰腺组织与脑损伤组织病理变化,探讨是否能够通过该模型的建立导致大鼠胰腺炎相关性脑损伤(PE),以及TLR4在急性重症胰腺炎(SAP)并发脑损伤中的表达作用。方法:将雄性SD大鼠随机分为3组,每组16只,分别为假手术对照组(Control)、生理盐水组(Nacl)、急性重症胰腺炎组(SAP),采用逆行胰胆管注射的方法,制成急性胰腺炎大鼠模型。应用酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)法检测各组大鼠血清中AMY、LIPA、IL-6以及TLR4表达水平;HE染色光镜下观察建模后胰腺组织及急性重症胰腺炎(SAP)组脑组织的病理变化并行病理组织学评分。应用蛋白免疫印迹实验(Western blot,WB)及实时定量PCR(qRT-PCR)法检测急性重症胰腺炎组(SAP)脑组织的TLR4的表达。统计学分析胰腺组织和脑组织病理评分之间的相关性,探讨TLR4在急性胰腺炎时表达作用以及急性重症胰腺炎脑损伤的建模方法。结果:假手术对照组(Control)胰腺无出血水肿,未见明显改变;生理盐水组(Nacl组)见胰腺周围轻度水肿,少量腹水,光镜下可见胰腺组织间质显著增宽,小叶间隙增大,胰腺细胞水肿;而经胰胆管逆行注射5%牛磺胆酸钠(T8510,Solarbio)建立的SAP模型组24小时后半数大鼠出现胰腺出血、坏死,光镜下见胰腺组织间质显著增宽,大量炎性细胞浸润,胰腺局灶或片状坏死。胰腺病理组织学评分SAP组与Nacl组、Control组比较,差异有统计学意义;Nacl组与Control组比较差异较为显著;SAP组大鼠符合坏死出血性胰腺炎的病理改变。建模24小时后,观察脑组织病理变化见SAP组部分大鼠光镜可见脑组织水肿,主要表现在神经元细胞周围空白间隙,血管内皮细胞内陷周围有较大腔隙,光镜还可见到少数神经元细胞核溶解固缩。生理盐水组(Nacl组)脑组织无出血水肿,未见明显改变;假手术对照组(Control),脑组织未见明显异常。采用Western blot法检测各组脑组织中的TLR4蛋白相对表达水平,其中SAP组为4.53±1.081,Nacl组1.83±0.949,两组之间比较差异显著,P<0.01;采用RT-PCR法检测各组脑组织中TLR4 mRNA相对表达情况,其中SAP组为3.06±1.161,Nacl组1.31±0.849,SAP组与Nacl组两组之间比较差异显著,P<0.01。结论:1、通过TLR4、淀粉酶、脂肪酶、IL-6在大鼠急性重症胰腺炎血清中的表达情况,说明TLR4可能参与了大鼠急性胰腺炎的发病过程并与其严重程度有关。2、造模后胰腺及脑组织的病理及脑指数的变化,说明通过建立大鼠急性重症胰腺炎的模型,可以诱发大鼠胰腺炎相关性脑损伤。3、通过TLR4在大鼠急性重症胰腺炎脑损伤组织中的表达,其可能为大鼠急性胰腺炎脑损伤的发病机制之一。第二部分si RNA靶向干扰TLR4基因后大鼠相关指标的表达及作用机制目的:通过第一部分中大鼠急性重症胰腺炎引发脑损伤造模成功,并通过检测得知TLR4在胰腺炎脑损伤组织中的表达上调说明其可能与急性坏死性胰腺炎时脑损伤发病相关,本部分将沿用之前的方法建立急性重症胰腺炎脑损伤模型,并应用RNA干扰(RNAi)技术,使用大鼠脑立体定位仪侧脑室局部靶点部位注射TLR4 si RNA,对目的基因的表达进行干预,检测急性重症胰腺炎时脑组织中TLR4、髓样分化因子88(myeloid differentiation factor88,My D88)及IL-6表达的情况,验证大鼠立体定位侧脑室注射si RNA对TLR4进行干预是否有效,并进一步探讨TLR4在急性胰腺炎脑损伤中的表达及相关作用机制,寻求可能的治疗靶点。方法:将64只SD大鼠随机分为4组,分别生理盐水对照组(Nacl)、急性重症胰腺炎组(SAP)、TLR4激动剂组(LPS)、TLR4 si RNA组(si RNA),同第一部分采用逆行胰胆管注射药物的方法建立大鼠急性胰腺炎模型,并采用大鼠脑立体定位仪侧脑室局部靶点部位注射给药方式对TLR4激动剂组和TLR4 si RNA组分别注射脂多糖(LPS)和TLR4 si RNA进行干预。建模及干预后HE染色光镜下观察各组脑组织的病理变化并行病理组织学评分,统计分析各组脑组织病理组织学评分间的相关性。应用蛋白免疫印迹实验(Western blot,WB)及实时定量PCR(q RT-PCR)法对各组大鼠脑组织的TLR4、My D88以及IL-6的相对表达情况进行检测并分析。结果:在Nacl组、SAP组、LPS组、si RNA四组间,脑组织TLR4蛋白及m RNA相对表达均存在显著差异。SAP组与Nacl组比较TLR4、My D88以及IL-6表达显著性增加,给予TLR4特异性激动剂组脂多糖刺激后LPS组表达较其余各组显著增加,差异具有统计学意义(P<0.05);而给予TLR4特异性抑制剂后,si RNA组TLR4、My D88以及IL-6表达水平明显低于SAP组及LPS组,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:1、利用RNA干扰技术直接将搭载si RNA载体的TLR4 si RNA应用于局部靶点部位,可对目标基因的表达进行有效的调控。2、进一步论证了TLR4通过My D88依赖途径介导IL-6等炎症因子释放可能是大鼠胰腺炎脑损伤的发病机制之一。3、TLR4的表达情况与大鼠胰腺炎脑损伤的严重程度相关,为胰腺炎脑损伤提供一种可能的治疗靶点。