蚯蚓（EisemiaFoetida）又称地龙、曲蟮，环节动物门寡毛纲陆生动物。我国对蚯蚓的药用历史悠久，是一种传统的中药。全世界已知的蚯蚓种类有3000多种，分为水栖种类、陆栖种类以及少数寄生，可供养殖的陆栖蚯蚓种类只有十几种。　　 随着现代生物技术的发展关于蚯蚓的药理活性的研究也越来越多，但是主要还是集中在其纤溶活性方面，关于其他的药理活性的研究还很少，将提纯后的蚯蚓蛋白制成外用凝胶剂用于烫伤治疗的研究就更少了，而能查到的蚯蚓治疗烫伤的资料也主要是停留在对蚯蚓未分离纯化的混合物的研究。民间中医使用蚯蚓捣烂外敷治疗烧烫伤效果显著，为了寻找蚯蚓中治疗烫伤的有效成分，本论文对蚯蚓蛋白进行了分离纯化，得到了一种对大鼠深II度烫伤具有良好的促进愈合效果的蛋白组分EFP-2-2，并对其可能的促进愈合作用的机理进行了研究。论文主要内容如下：　　 1.蚯蚓蛋白的分离提取。将鲜活蚯蚓冰浴匀浆，硫酸铵盐析，透析48h后冻干即得蚯蚓粗蛋白EFP，得率为13.4％。对蚯蚓粗蛋白EFP进一步分离纯化及活性组分筛选。采用NIH3T3成纤维细胞为实验材料，以促进其增殖为主要指标，通过逐级分离纯化与促进NIH3T3细胞增殖实验相结合的方法，筛选得到生物活性强的蚯蚓蛋白EFP-2-2，确定了EFP-2-2的分离纯化条件：蚯蚓粗蛋白冻干粉加水溶解，通过DEAESepharoseFastFlow离子柱，20mmol/L，pH7.8的磷酸盐缓冲液洗脱两个柱体积，然后用2mol/L氯化钠溶液进行线性洗脱，紫外检测器280nm检测到4个峰，收集活性高的第二个峰(EFP-2)浓缩并冷冻干燥；EFP-2加水溶解，通过superdex75凝胶柱，蒸馏水洗脱，紫外检测器280nm检测得到2个峰，收集活性高的第二个峰，透析（截留分子量3500）除盐，浓缩并冷冻干燥得蚯蚓活性蛋白EFP-2-2。　　 2.蚯蚓蛋白EFP-2-2对NIH3T3细胞的作用研究。选取烫伤愈合中的优势细胞NIH3T3成纤维细胞为研究对象，MTT法检测细胞增殖率结果表明，EFP-2-2在高剂量(10ug/ml)时促进增殖作用最好，与模型组比较细胞数量明显增多，且此增殖作用呈现出一定的剂量依赖性；NIH3T3细胞的划痕愈合实验结果分析表明，给药48h后不同浓度的EFP-2-2都有促进NIH3T3细胞划痕创面愈合的作用，且EFP-2-2在高剂量组(10ug/ml)时这种促进划痕创面愈合的作用最好，其给药48h后划痕创面已经基本愈合；羟脯氨酸测定结果表明不同浓度的蚯蚓蛋白都有增加培养基中羟脯氨酸含量的作用，且EFP-2-2在高剂量组(10ug/ml)时的这种促进作用最好，其统计学结果与模型组比较具有显著差异(P<0.01)。　　 3.凝胶剂的制备及性质考察。本实验选择卡波姆-940为凝胶基质，甘油、丙二醇为保湿剂，尼泊金乙酯为防腐剂，三乙醇胺为pH调节剂，选择将卡波姆-940自然溶胀的方法制成卡波姆溶液，再加入pH调节剂制成凝胶剂。实验制成的凝胶剂外观均匀、无色透明，兼具水化吸收双重功效，高温低温下物理化学性质稳定，可以进行高温高压蒸汽灭菌而外观、性质不发生变化，是非常理想的外用创伤敷料。　　 4.蚯蚓蛋白EFP-2-2对大鼠深II度烫伤的促进愈合作用。实验将蚯蚓蛋白EFP-2-2加入到凝胶剂中制成蚯蚓蛋白外用凝胶剂，探讨其对大鼠深II度烫伤的促进愈合作用。生化指标和形态学结果表明：对烫伤愈合率和烫伤愈合时间进行分析，我们发现高剂量组的EFP-2-2能够明显地提高烫伤愈合率和缩短烫伤愈合时间：对早期创面含水量进行分析表明EFP-2-2能够明显减少创面早期水肿；Masson三色染色法结果表明EFP-2-2组未变性的蓝色区域明显多于模型组，具有减少早期创面胶原变性的作用；羟脯氨酸含量测定结果表明，EFP-2-2可以增加创面羟脯氨酸含量。　　 5.蚯蚓蛋白EFP-2-2的初步结构研究。考马斯亮蓝法测定蚯蚓蛋白EFP-2-2的蛋白含量为61.25％;紫外-可见光谱发现蚯蚓蛋白EFP-2-2在210nm和280hm波长有较强的紫外吸收；SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳发现所分离得到的蛋白共有两个蛋白泳带，进一步采用凝胶定量软件QuantityOne对SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分子量预测发现我们分离的两种蛋白分子量分别是22.31KDa、18.01KDa。　　 本课题通过逐级分离纯化与细胞实验相结合的方法，得到生物活性强的蚯蚓蛋白EFP-2-2，并对其性质进行了初步的分析。实验结果表明EFP-2-2具有促进大鼠深II度烫伤愈合作用，且对NIH3T3细胞具有明显的促增殖作用。本实验从蚯蚓中发掘出具有促进烫伤愈合的蛋白成分，并将其添加到凝胶剂中用于大鼠深II度烫伤模型，对其开发成外用烫伤制剂的研究提供了一定的理论依据。