实验目的：　　 对刚地弓形虫磷酸甘油酸变位酶2（TgPGAM2）基因进行生物信息学分析，并对该基因进行克隆、表达，表达产物纯化后分析其免疫原性；观察重组弓形虫磷酸甘油酸变位酶2蛋白（rTgPGAM2)免疫小鼠诱导的黏膜及系统免疫应答及其抗弓形虫感染的能力，探讨TgPGAM2作为弓形虫疫苗候选抗原的可能性。　　 实验方法：　　 第一部分：综述脊椎动物、无脊椎动物、原生动物等不同来源PGAM蛋白的理化性质及研究进展。　　 第二部分：对TgPGAM2基因的主要特性及抗原表位进行生物信息学分析。利用蛋白分析专家系统（ExPASy)提供的ProtParam、SOSUI、TMHMM、HNN、MotifScan，NCBI上的ORF finder、Bcepred等生物信息学在线分析程序，结合Gene Runner、DNAman等生物信息学软件，分析、预测TgPGAM2蛋白的理化性质、可溶性、表面可及性、可塑性，跨膜区，翻译后修饰位点、亲（疏）水性、二级结构、抗原表位等。　　 第三部分：构建重组质粒pET30a/TgPGAM2，并在大肠杆菌中高效表达可溶性蛋白。对原核表达的rTgPGAM2进行纯化及免疫原性分析。收集、纯化RH株弓形虫速殖子，提取总RNA;设计合成引物并引入KpnI和BamHI酶切位点，RT-PCR扩增编码TgPGAM2的基因片段克隆到原核表达质粒pET30a中，阳性克隆经双酶切、PCR及测序鉴定阳性克隆；在大肠杆菌BL21(DE3)中用IPTG诱导表达，表达产物经SDS-PAGE进行鉴定。大量表达rTgPGAM2，以Ni-NTA层析法纯化蛋白，用兔抗弓形虫血清做Western blotting分析其免疫原性。　　 第四部分：观察不同剂量rTgPGAM2滴鼻免疫小鼠诱导的黏膜和系统免疫应答及抗弓形虫感染作用。BALB/c小鼠60只随机分为5组，免疫组分别用10μg、20μg、30μg、40μgrTgPGAM2/只滴鼻免疫小鼠，免疫2次，间隔2周，rTgPGAM2溶于20μl PBS中，对照组用等量PBS滴鼻。末次免疫后第14d，随机取每组5只小鼠，颈椎脱臼处死，检测肠液slgA和血清IgG、IL-2、IL-4、IFN-γ，分离并计数肠上皮内淋巴细胞(intestinAlintraepitheliallymphocytes，IEL)及脾淋巴细胞。其余35只小鼠每只用1×104个速殖子灌胃，观察小鼠健康情况。攻击后第30d，颈椎脱臼处死小鼠，计数肝、脑组织内弓形虫速殖子。　　 实验结果：　　 通过生物信息学分析发现，刚地弓形虫PGAM2有10个表面可及性参数≥1.9的区域、3个亲水性参数得分≥1.9的区域、3个柔韧性参数得分≥2的区域、8个翻译后修饰位点、16个潜在抗原表位，可能具有免疫原性。　　 以RH株弓形虫速殖子的cDNA为摸板，扩增获得756bp的TgPGAM2基因片段，并成功构建重组质粒pET30a/TgPGAM2; IPTG诱导后行SDS-PAGE分析，结果表明目的基因在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达，相对分子量(Mr)约30ku。Western blotting显示，纯化后的rTgPGAM2能被兔抗弓形虫免疫血清识别。　　 30μg组血清IgG(A495=0.9704)、IFN-γ（A405=0.8456），肠液IgA（A495=0.9098）高于20μg组（血清IgG、IFN-γ，肠液IgA A495分别为0.8213、0.7244、0.6504），组间差别有统计学意义（F=8.741，F=4.53，F=6.94，P<0.05）。血清IL-2和IL-4组间差别无统计学意义。攻虫后第7～14d，各组小鼠均出现倦怠、活动减少、饮水及采食减少等表现，对照组小鼠死亡2只；40μg组1只。30μg组肝(58.3×105/g)、脑(3.99×105/g)组织内速殖子虫荷显著低于对照组（肝93.88×105/g、脑5.65×105/g）和10μg组（肝85.54×105/g、脑4.86×105/g），组间差别有统计学意义(F=8.56，F=9.31，F=7.39，F=9.68，P＜0.05)。　　 结论：　　 通过生物信息学分析发现，刚地弓形虫PGAM2存在16个潜在的抗原表位，可能具有免疫原性。成功构建重组质粒pET30a/TgPGAM2并在大肠杆菌中高效表达可溶性蛋白。原核系统表达的rTgPGAM2具有免疫原性。30μg组rTgPGAM2滴鼻免疫更有效诱导了黏膜和系统免疫应答，并有效降低弓形虫感染鼠肝、脑组织中的虫荷。本研究的结果表明，刚地弓形虫PGAM2具有免疫原性，并能诱导有效的黏膜和免疫应答，有可能作为弓形虫疫苗的候选抗原。