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肺纤维化（pulmonary fibrosis，PF）是一种严重的肺间质疾病，主要病理特点是早期的弥漫性肺泡炎，后期大量成纤维细胞病理性增殖转型及细胞外基质（extracellular matrix，ECM）进行性异常积聚并取代正常的肺组织结构[1]。肺纤维化发病受多种因素的共同影响，尤其是大量细胞因子的刺激作用，使成纤维细胞（FB）不断地增殖和转型为肌成纤维细胞（myofibroblast，MB）[2]。流行病学调查发现，肺纤维化的发病率、死亡率不断上升，而且随着年龄的增长，其发病率和死亡率也逐渐升高。目前，对PF的药物治疗主要以糖皮质激素和免疫抑制剂为主，但效果均不理想[3]。深入探讨其发病机制，寻找新的药物靶点，一直是国内外药物研究的热点。瞬时受体电位通道（transient receptor potential channels, TRP channel）是位于细胞膜上的一类重要的阳离子通道，瞬时受体电位通道7（TRPM7）是TRP家族成员之一，是一种具有阳离子通道和蛋白激酶双重结构的双功能膜蛋白，可使自身或底物磷酸化，也被称为“通道酶”[4,5]。文献报道，TRPM7广泛存在于机体组织中，参与细胞的生长、增殖、迁移、凋亡等多种生理病理过程[6,7]，并在纤维化疾病的发病过程中具有重要作用[8,9]。但其在肺纤维化中的作用还未见文献报道。本实验选用人胚肺成纤维细胞系MRC-5为研究对象，观察TRPM7对MRC-5细胞增殖及分化的影响，并探讨其可能的作用机制。主要研究内容概括如下：1. TRPM7在人胚肺成纤维细胞系MRC-5中的表达本实验通过TGF-β1刺激人胚肺成纤维细胞MRC-5，RT-PCR和Western blot检测MRC-5中TRPM7的表达情况。结果显示，TGF-β1刺激组，TRPM7的表达明显高于正常组。2.抑制TRPM7表达对人胚肺成纤维细胞系MRC-5增殖及分化的影响采用MTT比色法测定TRPM7非特异性阻断剂Gd3+或2-APB对MRC-5的增殖抑制率；流式细胞术检测MRC-5周期变化；RT-PCR检测TRPM7、α-SMA、Collagen mRNA的表达变化；Western blot检测α-SMA、Collagen蛋白的表达水平。结果显示，Gd3+或2-APB能够不同程度的降低MRC-5中TRPM7mRNA的表达，并且在一定范围内抑制MRC-5的增殖。进一步研究TRPM7对MRC-5细胞周期的影响，结果发现，TRPM7阻断剂Gd3+或2-APB可通过促使细胞聚积于G0/G1期，降低G2/M期及S期细胞，影响MRC-5细胞的增殖。同时，Gd3+或2-APB能够降低MRC-5中α-SMA、Collagen的mRNA和蛋白的表达，表明下调TRPM7的表达可抑制MRC-5的增殖和分化。利用LipofectamineTM2000将特异性的TRPM7-siRNA转染到MRC-5中，下调TRPM7在人胚肺成纤维细胞系MRC-5中的表达。分别运用流式细胞术检测MRC-5细胞周期的影响；RT-PCR及Western blot法检测TRPM7、α-SMA、Collagen mRNA和蛋白的表达。结果提示，与对照组相比，TRPM7-siRNA转染组细胞增殖受到抑制，肺纤维化标志性蛋白α-SMA、Collagen的表达显著下降。3. TRPM7对人胚肺成纤维细胞系MRC-5中PI3K/AKT信号通路的影响给予TGF-β1体外诱导肺纤维化模型，再分别给予PI3K/AKT通路特异性阻断剂LY294002、离子通道阻断剂Gd3+、2-APB处理，MTT检测细胞增殖抑制率，Western blot法检测p-Akt、t-Akt蛋白的表达。结果提示，与正常组比较，TGF-β1明显促进MRC-5的增殖，而给予LY294002干预后，MRC-5的增殖明显受到抑制，同时TGF-β1能显著促进MRC-5p-Akt蛋白的表达，当使用LY294002、Gd3+、2-APB处理后，p-Akt蛋白表达均受到抑制，t-Akt蛋白表达无明显变化，更进一步研究发现，TRPM7-siRNA转染组p-Akt蛋白表达均受到抑制，t-Akt表达无明显变化。以上结果表明：下调TRPM7表达可以抑制MRC-5的增殖及分化，对肺纤维化具有一定的保护作用，其机制可能与调控PI3K/AKT信号通路有关。