目的碘是人体内一种重要的微量元素,是甲状腺激素(thyroid hormone, TH)合成的重要原料,并且影响甲状腺激素合成与分泌的若干中间环节,甲状腺功能的正常发挥直接受膳食中碘含量的调节。人类生存环境中缺碘可造成碘缺乏病,包括地方性甲状腺肿、克汀病、亚克汀病等。碘缺乏是导致人类智力障碍的重要原因之一。甲状腺激素是正常生长发育所必需的激素,具有促进组织分化、生长与发育成熟的作用,对脑的发育尤为重要。在碘缺乏病区普遍存在孕妇孕期碘供应不足的状况,母体碘的缺乏可直接导致子代脑发育期甲状腺激素供应不足,致使子代生长发育延迟,尤其是中枢神经系统的发育分化障碍。尽管我国已全面实施补碘多年,基本控制了地方性甲状腺肿及克汀病,但在原碘缺乏病区仍有大量碘缺乏导致的亚克汀病患儿存在,碘缺乏对儿童智力和体格广泛及严重的危害性已成为严重影响人口素质,阻碍发展的重大公共卫生问题。在生长发育过程中,海马组织终生存在神经可塑性现象；海马神经发育的改变,伴随着海马相关功能的改变。甲状腺功能减退能损害神经系统的发育和功能,而且碘缺乏能够引起子代中枢神经系统不可逆的损伤,这些机制都不是很明确。Caveolin-1, Synaptophysin, Doublecortin及Neural cell adhesion molecule (NCAM)在生长发育过程中发挥重要的作用：Caveolin-1在细胞迁移中调节细胞膜的成分和细胞表面的扩张,参与信号分子的极化和细胞骨架的重构；Synaptophysin是脑发育过程中常用的反应突触状态的指标,它一直被作为轴突终末特异性标志物,用以检测突触的密度和分布；Doublecortin通过调节新生神经元微管的细胞骨架结构和稳定性,促进未成熟神经元的迁移和分化；NCAM通过亲同性及亲异性结合,调节细胞轴突生长、迁移及目标识别。碘缺乏和甲状腺功能减退影响大鼠仔鼠海马发育过程中是否涉及到Caveolin-1, Synaptophysin, Doublecortin及NCAM-180的改变,CA1区、CA3区和DG区这几种蛋白的变化规律如何,各区的变化是否不同,目前尚不清楚。据此,我们采用碘缺乏饲料和不同剂量的丙基硫尿嘧啶(Propylthiouracil, PTU)饮水建立碘缺乏和甲状腺功能减退动物模型,观察低甲状腺素状态下海马CA1区、CA3区和DG区的受损状况,应用Western Blotting技术检测不同发育阶段仔鼠海马CA1区、CA3区和DG区Caveolin-1, Synaptophysin, Doublecortin及NCAM-180的变化规律,探讨碘缺乏和甲状腺功能减退导致神经系统发育损害的机制,为碘缺乏性智力低下性疾病的预防提供实验基础和理论依据。实验方法1、实验动物与分组健康2月龄雌性Wistar大鼠,体重250 g-280 g。取孕鼠28只,按体重均衡原则随机分为4组,每组7只孕鼠,分组及饮食为：碘缺乏组,缺碘饲料+自来水；5 ppm PTU组,普通饲料+5 ppm PTU+自来水；15ppm PTU组,普通饲料+15 ppm PTU+自来水；对照组,普通饲料+自来水。自妊娠第6天(Gestational day 6, GD6)起,按照上述方式喂养,直至仔鼠出生后第28天(Postnatal day 28, PN28);此后至PN42,各组均饲以普通饲料,饮用自来水。PN4时,每窝按雌雄数量尽可能相等的原则保留9-10只仔鼠。PN25时断乳、分笼饲养。PN14、PN21、PN28和PN42时,每组随机从不同窝中各抽取8只仔鼠,其中5只仔鼠灌流固定大脑,用于大脑组织病理切片和形态学观察；另3只仔鼠剥离大脑组织,用于Western Blotting测定。2、仔鼠体重及血清TSH、TH测定分别于PN14、PN21、PN28和PN42时称取仔鼠体重。在PN14、PN21、PN28和PN42时,每组分别随机选取8只仔鼠,开胸采血,3000 rpm离心5 min,取上清。采用固相化学免疫发光法测定血清中游离四碘甲状腺原氨酸(FT4)、游离三碘甲状腺原氨酸(FT3)和促甲状腺激素(TSH)的含量。3、海马CA1区、CA3区和DG区存活神经元观察各组于PN14、PN21、PN28和PN42分别取5只大鼠,采血后,固定大脑,常规石蜡包埋,行冠状位连续切片(6μm),当观察到切片包含完整的海马CA1区、CA3区和DG区时,每隔5～6张连续切片收集1张,制成石蜡切片。每只仔鼠随机选取3张切片,行尼氏染色(Nissl Staining),镜下观察CA1区、CA3区和DG区神经元形态结构,计数每个视野下存活神经元数,取其平均值。4、海马CA1区、CA3区和DG区神经纤维观察各组于PN14、PN21、PN28和PN42分别取5只大鼠,采血后,固定大脑,常规石蜡包埋,行冠状位连续切片(6μm),当观察到切片包含完整的海马CA1区、CA3区和DG区时,每隔5～6张连续切片收集1张,制成石蜡切片。每只仔鼠随机选取3张切片,行镀银染色(Silver Staining),镜下观察CA1区、CA3区和DG区神经纤维形态结构及其变化规律。5、海马CA1区、CA3区和DG区相关蛋白检测分析在PN14、PN21、PN28和PN42时,每组分别从不同窝中随机选取3只仔鼠,取大脑组织,剥离海马,按其组织学结构切分为CA1区、CA3区和DG区。采用Western Blotting技术分别检测各区Caveolin-1, Synaptophysin, Doublecortin及NCAM-180的表达。6、统计学处理采用SPSS12.0建立数据库,进行统计分析。结果表示为Mean±SD。Caveolin-1, Synaptophysin, Doublecortin及NCAM-180表达的主效应分析采用3×4×4析因设计方差分析；在PN14、PN21、PN28和PN42时,各组仔鼠体重,CA1区、CA3区和DG区存活细胞数,Caveolin-1, Synaptophysin, Doublecortin及NCAM-180表达的比较均采用单因素方差分析(ANOVA)。满足方差齐性时,两两比较采用最小显著差值法(Least-significant Difference, LSD);不满足方差齐性时,两两比较采用Dunnett’s T3法。P<0.05时差异有统计学意义,方差齐性检验水准定为0.1。结果1、大鼠仔鼠激素含量的变化在PN14-PN28期间,碘缺乏组、5 ppm PTU处理组和15 ppm PTU处理组仔鼠的甲状腺激素含量较对照组明显下降,差别有统计学意义(P<0.05),而TSH含量则反馈性较对照组升高；提示甲状腺功能减退。停止碘缺乏饲料及PTU饮水后,PN42时观察到激素水平基本恢复(P>0.05)。2、大鼠仔鼠体重的变化对照组子代大鼠体重增长较快,碘缺乏组及PTU处理组(5 ppm和15 ppm)子代大鼠体重增长慢。对照组仔鼠的体重均显著高于碘缺乏组、5 ppm PTU处理组和15 ppm PTU处理组,差别有统计学意义(P<0.05)。3、碘缺乏与甲状腺功能减退对仔鼠海马神经元的影响在PN14时,对照组仔鼠海马CA1区、CA3区和DG区神经元形态正常,胞体排列整齐、紧密,胞膜和核仁清晰,尼氏小体密集,神经纤维数量少；碘缺乏组、5 ppm PTU处理组和15 ppm PTU处理组CA1区、CA3区和DG区神经元形态无明显病理损伤,较对照组无明显差异；神经元计数显示各组间存活细胞数差别无统计学意义(P>0.05)。在PN21,PN28和PN42时,与对照组相比,镜下可见碘缺乏组、5 ppm PTU处理组和15 ppm PTU处理组CA1区、CA3区和DG区神经元形态较规则,胞体排列稀疏、较整齐,神经纤维数量少；其中PN42时,可见神经纤维排列紊乱、扭曲或断裂现象；神经元计数显示实验组较对照组存活细胞数少,差别有统计学意义(P<0.05)。4、碘缺乏与甲状腺功能减退对仔鼠海马Caveolin-1Synaptophysin、Doublecortin及NCAM-180表达的影响在PN14,PN21,PN28和PN42时,仔鼠海马CA1区、CA3区和DG区的Western Blotting结果显示,Caveolin-1表达碘缺乏组和15 ppm PTU处理组较对照组明显增多,差别有统计学意义(P<0.05),5 ppm PTU处理组虽较对照组增多,但仅CA1区和CA3区部分时间点差别有统计学意义；Synaptophysin表达碘缺乏组和15 ppm PTU处理组较对照组明显降低,差别有统计学意义(P<0.05),5ppmPTU处理组与对照组相比,差别无统计学意义(P>0.05); Doublecortin表达碘缺乏组和15 ppm PTU处理组较对照组明显降低,差别有统计学意义(P<0.05),5 ppm PTU处理组虽较对照组降低,但仅部分时间点差别有统计学意义；NCAM-180表达碘缺乏组和15 ppm PTU处理组较对照组明显增多,差别有统计学意义(P<0.05),5 ppm PTU处理组虽较对照组增多,但仅DG区个别时间点差别有统计学意义。结论1、用碘缺乏饲料和不同剂量PTU饮水建立甲状腺功能减退大鼠仔鼠动物模型,发现仔鼠海马CA1区、CA3区和DG区存活神经细胞数减少,神经纤维受损。2、碘缺乏和甲状腺功能减退可导致Caveolin-1和NCAM-180表达增多,Doublecortin和Synaptophysin表达下降。3、即使PN42时TH和TSH水平基本恢复,但神经元损伤及蛋白水平的异常改变仍然存在。推测碘缺乏和甲状腺功能减退损伤仔鼠海马神经发育的机制可能是由于其上调海马区Caveolin-1和NCAM-180的蛋白水平及下调Doublecortin和Synaptophysin的蛋白水平。