论文部分内容阅读
IGFs系统由IGFs（IGF-I和IGF-II），IGF结合蛋白（IGFBPs）以及IGFs受体（IGF-IR和IGF-IIR）组成。在血清中，IGFs是以与IGFBP结合的形式存在的。IGFBPs可以延长IGFs的半衰期，并且调节IGFs的作用。目前，从哺乳动物中已经分离出6种不同的IGFBPs，分别命名为IGFBP1-6，在斑马鱼中已经有5种IGFBPs被鉴别，分别是IGFBP-1，IGFBP-2，IGFBP-3，IGFBP-5和IGFBP-6。IGFBPs在多种组织中表达，对生物的生长发育有重要作用。IGFBPs既可以与IGFs相互作用发挥其生物学功能，另外，一些IGFBPs也具有独立的生物学活性，可以不依赖于IGFs直接发挥生物学作用。牙鲆（Paralichthys olivaceus）是目前我国非常重要的海水养殖经济鱼类之一，是研究鱼类生长发育机制的良好模型。近年来，IGFs系统在哺乳动物中的研究已经非常深入，但在鱼类中的研究仅限于鲑鳟鱼类、鲤科鱼类以及鲈形目等少数鱼类。目前，本课题组已经克隆IGF-I和其受体以及IGFBP-1基因的cDNA全长，并构建其在牙鲆生长发育过程中的基因表达谱，分析了IGFs在牙鲆变态发育过程中的作用。但对牙鲆其它IGFBPs对牙鲆生长发育的调节作用以及其在IGFs系统发挥激素调节时所发挥的作用还鲜有报道。本实验克隆了牙鲆IGFBP-2a、-2b、-3、-4和-5基因cDNA全长以及IGFBP-6基因的编码区，检测了其在牙鲆雌雄不同组织、不同发育时期的基因表达，分析了甲状腺激素对变态发育时期各IGFBPs表达量的影响，以及两种甲状腺激素即甲状腺氨酸（thyroxine，T4）和三碘甲状腺氨酸（triiodothyronine, T3）对牙鲆胚胎细胞中各IGFBPs表达量的影响。首先，从牙鲆肝脏组织中克隆得到牙鲆IGFBP-2a、-2b、-3、-4和-5基因cDNA全长以及IGFBP-6部分cDNA序列(包括完整的编码区)。预测的这六种IGFBPs的氨基酸序列与其它物种的IGFBPs相同，都存在两个典型的高保守区域：富含Cys残基的N端区域和富含Cys残基的C端区域。牙鲆IGFBPs的N端区域存在典型的GCGCCXXC结构域；而C端区域，除IGFBP-6外，都存在典型的CWCV区域。利用Real-time PCR检测了六种IGFBPs基因的表达情况。六种结合蛋白在牙鲆雌雄成鱼各组织(心脏、肝脏、脾脏、胃、肾脏、脑、鳃、性腺、肌肉以及肠)中都有不同程度表达。有趣的是，IGFBP-2a、-3、-4、-5以及-6五种基因在雌鱼各组织中表达量明显高于雄鱼，而IGFBP-2b则恰恰相反，在雌鱼中表达量明显低于雄鱼，这种雌雄鱼之间的表达差异可能与牙鲆雌雄生长速度不一致有关。六种结合蛋白在胚胎以及仔鱼各时期都有不同程度表达。IGFBP-2a在胚胎各时期表达量相对较高，孵化后仔鱼中的表达量明显降低；而IGFBP-2b在胚胎各时期几乎不表达，孵化后仔鱼中表达量明显升高。IGFBP-3在胚胎以及仔鱼各时期都保持较高表达水平；IGFBP-4在胚胎时期几乎不表达，而孵化后的仔鱼中表达量明显升高；IGFBP-5基因与IGFBP-3类似在整个发育过程中都保持较高表达量；而IGFBP-6基因在胚胎发育以及仔鱼各时期均保持低水平。其中，IGFBP-2b、-3、-4以及-5mRNA表达在仔鱼变态发育时期表达量都有明显变化。业已证明，外源性的甲状腺激素（thyroid，TH）包括甲状腺氨酸（thyroxine，T4）和三碘甲状腺氨酸（triiodothyronine, T3）都可以刺激牙鲆变态，而外源性甲状腺抑制剂，硫脲（thiourea，TU）可导致变态发育停滞。近期有研究表明，在牙鲆变态阶段，T4水平显著增高，T3在整个变态发育过程中并没有明显变化。为研究甲状腺激素对变态发育时期IGFBPs基因表达量的影响，将15日龄仔鱼用一定浓度T4和TU处理，取不同时间点样品用Real-time PCR进行检测。发现甲状腺激素对IGFBP-2b、-3、-4mRNA表达量有明显影响，而对IGFBP-2a、-5以及-6的影响名不明显。为了进一步研究甲状腺激素与IGFBPs之间的关系，分别用不同浓度梯度的T3和T4处理牙鲆胚胎细胞，取不同时间点样品，并用Real-time PCR检测各IGFBPs基因表达量变化。各IGFBPs基因表达量都不同程度受到两种激素影响，T3的影响更快，而T4则较为缓慢，但效果明显比T3好，证明T4是对牙鲆变态起主要作用的激素。本研究为进一步研究IGFs系统与鲆鲽鱼类变态发育之间的关系提供了基础资料和信息。