论文部分内容阅读
周围神经损伤后，由于神经元内在再生能力的激活以及施万细胞提供的再生微环境，周围神经能够实现成功再生，重新支配靶肌。L4-L6背根神经节（dorsal rootganglia，DRG）神经元是一种感觉神经元，其轴突分支组成了坐骨神经。在坐骨神经损伤后DRG神经元能维持存活和轴突再生，这个过程涉及众多转录因子的激活和再生相关基因的转录调控。非编码RNA （non-coding RNA），包括microRNA （miRNA）为代表的小RNA和长链非编码RNA（lncRNA, long non-coding RNA)，构成复杂的调控网络，在表观遗传、转录及转录后等层面调控基因表达。miRNA是一类长约22个核苷酸的非编码RNA，由一段具有发夹结构的单链RNA前体经Drosha酶和Dicer酶剪切后生成。miRNA可以靶向目标mRNA分子3‘端非翻译区（3‘-UTR），使mRNA分子降解或翻译受到抑制，在转录后水平负调控许多基因的表达。研究表明miRNA参与细胞的凋亡、增殖、迁移、分化、发育和代谢等过程，在许多生理和病理过程中起到非常重要的作用。LncRNA指的是长度在200bp以上的RNA分子，由于它们不编码蛋白，起初被认为是基因组转录的“噪音”。然而，近年来的研究表明，lncRNA参与了染色质修饰，转录激活和干扰，核内运输等多种重要的调控过程。lncRNA的种类远远超过编码RNA，但绝大多数功能不清楚。本文拟在坐骨神经损伤模型中，通过miRNA和lncRNA芯片，筛选出调控背根神经节神经元表型，激活其内在再生能力的非编码RNA。第一部分miR-21和miR-222靶向TIMP3抑制DRG神经元的凋亡目的：寻找调控DRG神经元凋亡的miRNA，并探讨其作用机制。方法：1.采用Agilent miRNA和mRNA芯片，对大鼠坐骨神经损伤后0d，1d，4d和7d的L4-L6DRG中miRNA和mRNA的表达谱进行了系统性分析。2.运用生物信息分析软件预测差异表达miRNA的靶基因（TargetScan、miRanda）及其功能富集情况（GO）。3.对芯片结果进行qRT-PCR验证。4.结合芯片验证情况和生物信息学分析选取部分miRNA在体外培养的背根神经节神经元中进行功能学研究。通过流式凋亡检测分析了神经元中过表达miR-21和miR-222模拟物对背根神经节神经元凋亡的影响。5.通过CCK-8细胞活力检测分析过表达miR-21和miR-222模拟物对背根神经节神经元细胞活力的影响。6. Western blot检测分析过表达miR-21和miR-222模拟物对背根神经节神经元细胞Caspase-3活化的影响。7.结合芯片验证情况和生物信息学分析，确定TIMP3可能是miR-21和miR-222的靶基因。8.体外培养的神经元中过表达miR-21和miR-222模拟物，qRT-PCR和Western blot检测TIMP3mRNA和蛋白表达水平。9.检测调控miR-21表达的上游信号通路。在培养的DRG神经元中加入IL-6，收集细胞RNA，qRT-PCR检测miR-222及TIMP3的表达情况。结果：1.系统性分析了L4-L6背根神经节在损伤后4个不同时间点miRNA表达谱的变化，一共找到13个差异表达的miRNA。2.构建13个差异表达的miRNA和45个靶基因的网络图。3. qRT-PCR证实miR-21和miR-222的表达变化和芯片结果一致。4.流式凋亡检测发现过表达miR-21和miR-222抑制背根神经节神经元的凋亡。5. CCK-8细胞活力分析发现过表达miR-21和miR-222可以增加背根神经节神经元的存活。6. Western blot结果显示过表达miR-21和miR-222可以抑制Caspase-3的活化。7. qRT-PCR和Western blot结果显示，体外培养的神经元中过表达miR-21和miR-222抑制TIMP3mRNA和蛋白的表达。8. qRT-PCR结果显示IL-6激活可以上调背根神经节神经元中miR-21的表达，进而下调TIMP3mRNA的表达。结论：通过系统性分析坐骨神经损伤后L4-L6背根神经节miRNA的表达谱变化，结合生物信息学分析和功能筛选发现了miR-21和miR-222通过靶向TIMP3抑制背根神经节神经元的凋亡。另外，IL-6刺激背根神经节神经元可以上调miR-21的表达。这有助我们从新的角度解释周围神经损伤和修复的机制，为将来的临床治疗提供新的思路。第二部分miR-222靶向PTEN促进DRG神经元突起的生长目的：寻找调控DRG神经元突起生长的miRNA，并探讨其作用机制。方法：1.采用Agilent miRNA和mRNA芯片，对大鼠坐骨神经损伤后0d，1d，4d，7d和14d的L4-L6DRG中miRNA和mRNA的表达谱进行了系统性分析。2.运用生物信息分析软件预测差异表达miRNA的靶基因（TargetScan、miRanda）及其功能富集情况（GO）。3.对芯片结果进行qRT-PCR和原位杂交验证。4.结合芯片验证情况和生物信息学分析选取部分miRNA在体外培养的背根神经节神经元中进行功能学研究。通过测量神经元突起长度分析了在神经元中表达miR-222模拟物和抑制剂对背根神经节神经元突起生长的影响。5.结合芯片验证情况和生物信息学分析，确定PTEN可能是miR-222的靶基因。6.体外神经元中表达miR-222模拟物和抑制剂，qRT-PCR和Western blot检测PTEN mRNA和蛋白表达水平。7.设计siRNA干扰PTEN表达，检测PTEN对DRG神经元突起生长的作用，共转PTEN siRNA和miR-222抑制剂，确定PTEN是否为miR-222的功能性靶基因。8.检测miR-222调控的靶基因及其下游信号通路。Co-IP实验寻找DRG神经元中与PTEN共同起作用的基因。9.检测调控miR-222表达的上游信号通路。在培养的DRG神经元中加入c-Jun激活剂anisomycin，收集细胞RNA或蛋白，qRT-PCR或Western blot检测miR-222及PTEN的表达情况。10.检测调控DRG神经突起生长的不同信号通路之间的协调作用。在培养的DRG神经元过表达miR-222或PTEN siRNA，12h后加入cAMP激活剂Db-cAMP，分析突起的生长情况。结果：1.系统性分析了L4-L6背根神经节在损伤后5个不同时间点miRNA表达谱的变化，一共找到26个差异表达的miRNA。2.生物信息学分析表明26个差异表达miRNA的638个潜在靶基因参与了神经再生的众多生物学过程。3. qRT-PCR和原位杂交证实miR-222的表达变化和芯片结果一致。4.突起生长实验发现miR-222通过靶向PTEN促进背根神经节神经元突起的生长。5. Western blot结果显示过表达miR-222可以促进CREB磷酸化，Co-IP实验发现PTEN能与CREB发生相互作用。6. qRT-PCR结果显示c-Jun激活可以上调miR-222的表达。Western blot结果显示c-Jun激活可以下调PTEN表达，促进CREB磷酸化。7.通过miR-222或siRNA干扰PTEN，发现cAMP信号通路协同促进DRG神经元突起的生长。结论：通过系统性分析坐骨神经损伤后L4-L6背根神经节miRNA的表达谱变化，结合生物信息学分析和功能筛选发现了miR-222通过靶向PTEN促进背根神经节神经元突起的生长。另外，c-Jun激活上调miR-222的表达，miR-222也可以通过PTEN调节CREB磷酸化。这有助我们从新的角度解释周围神经损伤和修复的机制，为将来的临床治疗提供新的思路。第三部分LncRNABC089918抑制DRG神经元突起的生长目的：寻找调控DRG神经元突起生长的lncRNA，并探讨其作用机制。方法：1.采用Arraystar4×44K Rat LncRNA芯片，对大鼠坐骨神经损伤后0d，1d，4d和7d的L4-L6DRG中lncRNA和mRNA的表达谱进行了系统性分析。2.运用生物信息分析预测差异表达lncRNA相关的基因（共表达网络）及其功能富集情况（GO和KEGG）。3.对芯片结果进行qRT-PCR和原位杂交验证。4.结合芯片验证情况和生物信息学分析选取部分lncRNA在体外培养的背根神经节神经元中进行功能学研究。通过测量神经元突起长度分析了在神经元中siRNA干扰lncRNA BC089918对背根神经节神经元突起生长的影响。结果：1.系统性分析了L4-L6背根神经节在损伤后4个不同时间点lncRNA表达谱的变化，一共找到105个差异表达的lncRNAs。2.生物信息学分析表明与24个下调的差异表达lncRNAs共表达的115个相关基因参与了神经再生的众多生物学过程。3. qRT-PCR和原位杂交证实lncRNA BC089918的表达变化和芯片结果一致。4.突起生长实验发现siRNA干扰lncRNA BC089918的表达能促进背根神经节神经元突起的生长。结论：通过系统性分析坐骨神经损伤后L4-L6背根神经节lncRNA的表达谱变化，结合生物信息学分析和功能筛选发现了lncRNA BC089918抑制背根神经节神经元突起的生长。这有助我们从一全新的角度解释周围神经损伤和修复的机制，为将来的临床治疗提供一个新的思路。