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背景和目的:组织工程软骨是将软骨细胞与细胞外基质合成类正常软骨并且有功能的组织。其研究内容涵盖了种子细胞,生长因子,支架材料三方面。已证实骨髓间充质细胞(Mesenchymal stem cell,MSCs)为软骨组织工程中理想的种子细胞。生长因子具有促进细胞分化和增殖的重要作用,是决定MSCs分化方向的最主要因素。本课题组的前期实验已经利用基因芯片与生物信息学技术对大鼠MSCs,透明软骨细胞和弹性软骨细胞的差异表达基因进行了分析,结果显示软骨同源蛋白-1( cartilage homeoprotein 1,Cart-1 )和基质金属蛋白酶3 ( matrix metallopeptidase 3,Mmp3)在软骨细胞中高度表达,可能是诱导MSCs向软骨细胞分化的关键基因。研究表明Cart1促进软骨细胞外基质Ⅱ型胶原纤维的含量,而Mmp3调节软骨细胞外基质含量使之处于动态平衡。这两种基因在软骨细胞中高表达提示它们在软骨细胞形成过程中发挥重要作用。本实验通过Western Blot方法对Cart-1和Mmp3在MSCs,透明软骨细胞和弹性软骨细胞中的差异表达进行了蛋白质水平的验证,为下一步实验选择准确的生长因子来定向分化MSCs向软骨细胞方向分化奠定理论基础。方法:通过密度梯度离心法和贴壁培养法的联合应用提取SD大鼠的MSCs,酶消化法得到肋软骨透明软骨细胞和耳廓弹性软骨细胞,分别培养2-3代后提取细胞总蛋白,Western Blot检测Cart-1和Mmp3蛋白水平的表达并进行定量分析。结果:1、密度梯度离心结合贴壁培养法能分离出较为纯化的MSCs,细胞大都呈梭形贴壁生长,流式细胞仪测定其细胞表型结果符合MSCs的特性。2、Western Blot定量分析表明:(1)透明软骨细胞中Cart-1的表达明显高于MSCs(P<0.01),弹性软骨细胞中Cart-1蛋白的表达也高于MSCs(P<0.01),而透明软骨细胞和弹性软骨细胞中Cart-1蛋白的表达没有明显差异(P>0.01)。(2)Mmp3蛋白在透明软骨细胞表达高于MSCs(P<0.01),Mmp3蛋白在弹性软骨细胞中的表达高于MSCs(P<0.01),弹性软骨细胞中Mmp3蛋白表达高于透明软骨细胞中Mmp3蛋白表达(P<0.01)。结论:1、密度梯度离心法结合贴壁培养法能有效分离纯化大鼠MSCs。2、Cart-1蛋白在软骨细胞中高表达说明Cart-1可能在MSCs向软骨细胞分化过程中起定向诱导作用,提示Cart-1蛋白可能为定向诱导MSCs向软骨细胞分化的重要备选生物因子。3、Mmp3蛋白在弹性软骨细胞中高表达说明Mmp3可能在MSCs向弹性软骨细胞分化过程中起定向诱导作用,是MSCs向弹性软骨细胞方向分化的关键基因。