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丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)是引起慢性肝病的主要原因之一，据WHO估计报道，世界范围内HCV感染患者约为1.7亿，其中约75～85％感染者会发展为慢性肝炎（chronic hepatitis C，CHC），20％左右最终会发展为肝硬化、肝细胞癌等终末期疾病。 HCV基因可编码三种(Core，E1，E2)结构和七种(p7，NS2，NS3，NS4A，NS4B，NS5A，NS5B)非结构蛋白。研究表明，HCV核心蛋白（Core蛋白，C蛋白）与肝炎的慢性化及肝癌的发生发展有关。近年来，研究者在HCV患者血清中发现了一种新的蛋白，被命名为F蛋白，即ARFP(alternate reading frame protein)，是由Core基因发生核糖体读码框移位编码而产生。研究表明，F蛋白能上调Th2类细胞因子的表达，进而促进体液免疫应答并加剧HCV的感染慢性化。HCV感染转归所涉及的分子机制十分复杂，机体对病毒的免疫反应取决于抗原递呈细胞对抗原的加工、递呈以及免疫细胞识别这些抗原的能力，且这些功能由机体的人类白细胞抗原(Human leukocyte antigens，HLAs)所决定，HLAs在体液及细胞免疫应答过程中均发挥着重要的作用，其等位基因多态性决定着宿主免疫应答的能力。HLA-DP抗原主要分布于巨噬细胞、B淋巴细胞和活化的T细胞表面，通过其抗原表位与外源性抗原肽结合，将抗原肽信息递呈给T细胞，促进T细胞的增殖与活化。 T细胞免疫球蛋白粘蛋白分子-3(T-cell immunoglobulin and mucin domain-3，Tim-3)是Tim家族成员，高表达于分化的Th1和Tc1细胞上，在Th2细胞上不表达，也是区分Th1、Th2细胞的重要标记分子，活化的Tim-3与其配体半乳凝素-9(Galectin-9，Gal-9)结合，引起Th1和Tc1细胞增殖能力降低，IFN-γ产生下降，诱导T细胞凋亡。研究发现，在小鼠的肿瘤构建模型中，阻断Tim-3及其配体通路可显著抑制肿瘤细胞增长，甚至可达部分治愈的效果。作为免疫抑制性分子之一，Tim-3信号通路同样被证实在艾滋病毒(human immunodeficiency virus，HIV)、乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)和HCV等抗病毒感染中发挥着重要的作用。 本研究采用免疫学和分子流行病学研究方法，从三个方面探讨HLA-DPA1/B1基因多态性、Tim-3基因多态性及其信号通路与F蛋白在HCV感染中的相关性，研究结果将有助于阐明HCV感染的可能机理。 第一部分 HLA-DPA1/B1基因多态性与HCV感染的相关性 目的:探讨HLA-DPA1/B11基因多态性与HCV感染的关联性。 方法:采用病例-病例及病例-对照研究方法，将748例样本分为HCV持续感染组（258例）、HCV自限清除组（170例）和健康对照组（320例），并运用PCR-SSP/SBT技术对所有样本的HLA-DPA1/B1等位基因进行扩增、测序和鉴定。 结果:Logistic回归分析发现HLA-DPA1*0103和HLA-DPB1木0201位点显著增加了HCV感染的风险(P=0.003; P＜0.001)，HLA-DPA1*0201及HLA-DPB1*1401可能是HCV持续感染的危险基因(P=0.018; P=0.015)。单倍型分析发现，DPB1*0501-DPA1*0103和DPB1*0201-DPA1*0103为HCV感染的危险单倍型(P＜0.001:P＜0.001)，DPB1*0202-DPA1*0202为保护单倍型(P＜0.001);而DPB1*0402-DPA1*0103为HCV持续感染的危险单倍型（P=0.004），DPB1*0202-DPA1*0202为HCV持续感染的保护单倍型(P=0.008)。 结论:HLA-DPA1/B1基因多态性与HCV感染存在一定的关联。 第二部分 F蛋白与Tim-3基因多态性在HCV感染中的关联研究 目的:探讨HCV感染者Tim-3基因多态性与F蛋白的相关性。 方法:收集924例外周血样本，(HCV-F(+)558例、HCV-F(-)163例和健康者203例），分离外周血淋巴细胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)并提取DNA，运用改进的多重高温连接酶检测反应（improved multiple ligase detectionreaction，iMLDR）基因分型技术检测所有样本的Tim-3基因的三个单核苷酸多态性（Single nucleotide polymorphisms,SNPs）位点(rs10053538、rs12186731、rs13170556)基因型，并统计分析其分布频率。 结果:在HCV-F(+)组和HCV-F(-)组比较中rs12186731 CT、rs13170556 TC和rs13170556 CC基因型分布存在明显差异（P=0.005; P＜0.001; P＜0.001），rs13170556 TC能显著增加HCV感染的风险(P=0.002);对三个位点进行分层分析发现，rs13170556(TC+CC)在年轻和女性组中能显著增加HCV感染的风险(P=0.007; P＜0.001); HCV-F(+)组和HCV-F(-)组比较中，rs12186731(CT+TT)在年长和女性组中表现明显的统计学差异(P=0.002; P＜0.001)。 结论:Tim-3基因多态性与F蛋白的产生存在相关性。分层分析表明其基因多态性在不同年龄和性别组中显示有统计学意义的差异。 第三部分 Tim-3信号通路与F蛋白在HCV感染中的关联研究 目的:探讨Tim-3信号通路与F蛋白的产生在HCV感染中的关联性。 方法:收集192例外周血样本并提取PBMCs(HCV-F(+)79例、HCV-F(-)28例和健康者85例），阻断Tim-3信号通路，检测各组阻断前后PBMCs凋亡情况，并检测阻断前后各组IFN-γ、IL-4的表达水平，逆转录检测各组Tim-3 mRNA表达量，Western检测各组阻断前后STAT1/6磷酸化水平。 结果:Tim-3信号通路被阻断后，HCV感染患者PBMCs凋亡水平明显降低(P＜0.001)，且HCV-F(+)组凋亡率降低程度明显高于HCV-F(-)组(P＜0.001);IFN-γ水平较阻断前明显升高(P＜0.001)，且HCV-F(-)组升高程度高于HCV-F(+)组，IL-4水平较阻断前明显降低(P＜0.001)，且HCV-F(-)组降低程度低于HCV-F(+)组(P＜0.001); Tim-3 mRNA的表达量在HCV-F(+)组中明显低于HCV-F(-)组(p＜0.001);此外，随着Tim-3抗体阻断剂浓度的提高，HCV-F(-)组STAT1的磷酸化水平逐渐升高(P＜0.001)，而HCV-F(+)组STAT6磷酸化水平逐渐降低(P＜0.001)。 结论:Tim-3信号通路与F蛋白的产生在HCV感染中存在相关性。