配伍是方剂的核心和关键问题,方剂是配伍理论的直接体现形式,揭示方剂配伍规律的科学内涵是中医药现代化研究的重要组成部分。经方具有疗效确切、配伍精当的特点,以经方为切入点进行配伍规律的研究是可行且有实践意义的。方剂是中药在临床运用的主要形式,其临床疗效的发挥归功于复方中多种成分之间的相互作用。中药复方中不同配伍,包括药味组合及药物剂量,均能通过药味之间的相互作用使其中各成分溶解度及化学性质等发生变化,从而改变有效成分在靶组织的分布含量,发挥不同的治疗作用。中药复方中多成分之间的协同或拮抗作用,多体现在药物进入机体后的吸收、分布、代谢、排泄的过程。因此,复方通过配伍发挥作用的过程,可能是通过影响某些成分的生物利用度、改变其原来分布特点并调节体内药效的物质的成分,最后引起相应的药理效应来实现的。由此可知,对中药复方中有效成分进行药代动力学研究,可以部分地揭示中药配伍理论并在一定程度上阐明其配伍机制。基于中药活性成分单克隆抗体技术的酶联免疫吸附测定方法具有特异性强、灵敏度高、方便快捷等优势,相对于需要繁琐前处理步骤和对样本量有较高要求的色谱技术来说,更适合于中药复方有效成分的药代动力学研究。本论文中采用基于中药活性小分子单克隆抗体的技术方法,分析经方半夏泻心汤及葛根芩连汤在不同配伍条件下,有效成分黄芩苷、葛根素及人参皂苷Re的药代动力学特征变化,对其配伍规律特点进行初步阐释。研究将为中药复方多成分体内过程、物质基础和作用靶点的研究提供新思路和新方法,而所获得的结果也为进一步揭示经方的配伍机制奠定了一定的基础。目的：建立中药活性成分黄芩苷在小鼠血中的酶联免疫分析技术,用于解析半夏泻心汤不同性味拆方、君药剂量变化及葛根芩连汤不同药味配伍的药代动力学特征。方法：1 采用给小鼠腹腔注射杂交瘤细胞悬液的方法生产含黄芩苷单克隆抗体的腹水；辛酸硫酸铵沉淀法初步纯化生产的腹水,SDS-PAGE检测纯化前后抗体的纯度,Bradford法检测纯化前后抗体的含量,ELISA法测定抗体的效价和竞争；2利用生产的黄芩苷单克隆抗体建立黄芩苷在小鼠血中的酶联免疫分析法,并进行方法学考察,包括线性、特异性、精密度、准确性、回收率和稳定性等；3利用建立的酶联免疫分析法,解析半夏泻心汤及葛根芩连汤不同配伍的药代动力学特征：(1)半夏泻心汤全方包含苦味药(黄芩、黄连),辛味药(半夏、干姜),甘味药(人参、大枣、炙甘草),将半夏泻心汤按照不同性味拆方后分为苦药组、辛苦药组、苦甘药组及全方组,按照原方剂量对昆明小鼠给予灌胃给药,分别于给药前及给药后0.5h,1h,1.5h,2h,2.5h,3h,3.5h,4h,5h,6h,7h,8h,9h,10h,12h,36h多个时间点从小鼠尾尖取少量血(5μL),采用建立的酶联免疫分析法检测其中黄芩苷的含量,并绘制时间-浓度曲线,比较各组之间的差异,计算其药代动力学参数。(2)半夏泻心汤根据君药半夏剂量的变化,分为原方剂量组、高剂量组(1.5倍原方剂量)、低剂量组(0.5倍原方剂量),昆明小鼠给予灌胃给药,分别于给药前与给药后15min,30min, 1h,1.5h,2h,2.5h,3h,4h,5h,6h,7h,8h, 10h,12h多个时间点从小鼠尾尖取血(5μL),采用建立的酶联免疫分析法检测其中黄芩苷及人参皂苷Re的含量,并绘制时间-浓度曲线,比较各组之间的差异,计算两者的药代动力学参数。(3)葛根芩连汤中有葛根、黄芩、黄连及甘草四味药,分别为方中君臣佐使。将其分为全方组、全方去葛根组、全方去黄芩组及全方去黄连组后,灌胃给予昆明小鼠,分别于给药前及给药后2Omin,40min, 1h,1.5h,2h,2.5h,3h,3.5h,4h,5h,6h,7h,8h, 10h,12h于小鼠尾尖取血5gL,采用酶联免疫分析法检测小鼠血中葛根素、黄芩苷的含量,并绘制浓度-时间曲线,比较各组之间的差异,计算药代动力学参数。结果：1 生产并初步纯化的黄芩苷单克隆抗体,经SDS-PAGE检测腹水中杂蛋白明显减少,蛋白定量结果显示纯化前后浓度分别为6.54 mg/mL与2.40 mg/mL,ELISA结果显示纯化前后的黄芩苷单克隆抗体均与黄芩苷呈现良好线性竞争,线性范围为发生明显改变；2 建立的小鼠血中黄芩苷的酶联免疫分析法,其线性范围为7.81ng/mL-1000 ng/mL,回归方程y=-0.1431n(x)+1.2551(R2=0.9918),精密度及准确性良好,回收率为100.52%-104.02%,适合于生物样品的检测,检测稳定性良好；3利用建立的酶联免疫分析法,解析半夏泻心汤及葛根芩连汤不同配伍的药代动力学特征,结果如下：(1)半夏泻心汤不同性味配伍给药后,检测到苦药组和辛苦药组中黄芩苷的含量较苦甘药组及全方组低,而黄芩苷整体达峰时间分别在1-1.5 h与5-7 h,各组之间差异不大,经计算药代动力学参数后,发现在苦甘药组与全方组中黄芩苷的Cmax与AUCo-t几乎是苦药组和辛苦药组的三倍之多。(2)半夏泻心汤不同剂量半夏配伍给药后,检测到黄芩苷有两个主要吸收峰,分别在0.5 h与6-7 h,人参皂苷Re显示在浓度-时间曲线中显示出更多的峰形,高中低剂量组达峰时间差异不大；经计算药代动力学参数后,发现黄芩苷与人参皂苷Re的Cmax均随半夏剂量增加而增大,黄芩苷的AUC0-t值与半夏的用量呈线性增加关系(R2=0.9628),人参皂苷Re也存在相近的趋势。(3)葛根芩连汤不同配伍组给药后,检测到黄芩苷在小鼠血中出现多峰现象,其中两个主要峰形分别出现在1-3 h与7-8 h,经计算,去葛根组中黄芩苷的药代动力学参数Cmax,Tmax及AUCo-t均高于全方组及去黄连组；葛根素的出峰时间明显早于黄芩苷,两个主要峰形分别出现在20-60 min与7-9 h,但全方组的峰值Cmax低于去黄芩组及去黄连组,去黄芩组的AUCo-t值明显高于全方组及去黄连组。结论：1 利用单克隆抗体建立的酶联免疫分析法特异性强、灵敏度好,能够检测血液中的微量成分,并且实现了采用单一小动物连续多时间点微量取血检测的技术,使其能够更好地应用于少量生物样品中微量有效成分的药代动力学研究,同时为中药复方配伍理论的研究提供了一种可靠的技术支持；2利用酶联免疫分析技术解析半夏泻心汤及葛根芩连汤不同配伍的药代动力学特征,得出以下结论：(1)半夏泻心汤不同性味拆方配伍后,比较苦药、辛苦药及苦甘药各组与全方对黄芩苷含量变化,说明不同性味中药对其代谢过程产生不同影响,且与甘味药为配伍后黄芩苷显示出的峰值与曲线下面积明显高于其他组,间接验证了配伍中甘味调补的特性；(2)半夏泻心汤中的君药半夏剂量变化配伍后,对黄芩苷及人参皂苷Re含量变化有不同程度的影响,且两成分的曲线下面积与半夏的剂量改变呈正相关,验证了君药及剂量在配伍中的重要性；(3)葛根芩连汤中不同药味拆方配伍,将分别去除葛根、黄芩、黄连后与原方进行比较,发现各药味对葛根素及黄芩苷的代谢曲线产生不同影响,说明了不同药味在葛根芩连汤中配伍中起到不同的作用。