油橄榄是一种非常重要的木本油料作物,得到大面积的种植。每年因剪枝以及橄榄加工产生大量的油橄榄叶废弃物,油橄榄叶的清洁、高效利用已经成为亟待解决的问题。羟基酪醇具有很强的抗氧化性,可以预防心血管疾病、预防糖尿病、抗癌、抗炎等。本文以油橄榄叶的资源化利用为目标,针对羟基酪醇制备得率低的瓶颈,通过游离酶的筛选以及工艺条件的优化,研究获得高得率的羟基酪醇方法。同时,采用多种固定化方法,研究固定化酶在填充床反应器中多批次制备羟基酪醇,为羟基酪醇的工业化生产提供理论依据和技术指导。进一步研究了羟基酪醇的分离纯化以及橄榄苦苷和羟基酪醇的稳定性及抗氧化性。主要结果如下:⑴由单因素、正交实验及方差分析确定乙醇溶剂浸提法提取橄榄苦苷的最佳工艺:乙醇体积分数90%、浸提温度80 ^oC、浸提时间1.5 h、固液比1:40、油橄榄叶粒径20-40目。通过乙醇浸提、索氏提取与微波辅助提取三种方法的比较得出,橄榄苦苷的提取得率差别不大,分别为8.44%、8.34%和8.16%。这三种提取方法各有利弊。溶剂浸提法,可行性强,但消耗溶剂大。索氏提取操作简单,但耗时较长。微波萃取的效率高、时间短、试剂用量少、设备简单,但是处理量少,只适合极性物质的提取。⑵根据静态吸附、解吸实验,确定AB-8为橄榄苦苷的最佳吸附大孔树脂。橄榄苦苷粗提物经过AB-8大孔树脂处理前后,橄榄苦苷的纯度由18.8%提高到40.1%。AB-8大孔树脂的富集可以得到相对较高含量的橄榄苦苷提取物,而且大孔树脂价格便宜、可以反复使用、操作简单,适用于工业化生产。⑶采用游离酶从橄榄苦苷提取物制备高附加值的羟基酪醇优化后的最佳水解条件为:底物浓度20 g/L,纤维素酶CTec2的添加量每克绝干的橄榄苦苷提取物为5 FPU,酶水解在50 ^oC反应12 h,然后将温度升高到90 ^oC继续水解。纤维素酶CTec2在50 ^oC的条件,12 h后橄榄苦苷的浓度由最初的9.68 g/L下降到2.02 g/L,橄榄苦苷的降解率为79.58%。24 h时,橄榄苦苷完全降解。羟基酪醇的得率在12 h、24 h、36 h分别为24.83%、73.32%、84.03%。羟基酪醇的最高得率在48 h时达到88.90%。纤维素酶CTec2酶水解在50 ^oC反应12 h,然后将温度升高到90 ^oC继续水解,36-48 h后橄榄苦苷的降解率为100%,羟基酪醇的得率为84%-88%。高的羟基酪醇得率需要50 ^oC的酶水解和90 ^oC的高温水解两个阶段。前一阶段从橄榄苦苷释放葡萄糖,后一阶段促进酯键的裂解形成羟基酪醇。纤维素酶康地恩KDN的水解与CTec2相似。⑷在填充床反应器中,使用海藻酸钙小球、脱乙酰α-几丁质壳聚糖小球和多孔陶瓷球三种载体固定化纤维素酶CTec2,然后进行20批次的水解橄榄苦苷提取物制备羟基酪醇。初始纤维素酶的活力为10 FPU。橄榄苦苷提取物的浓度为20g/L。橄榄苦苷的降解率均高于90%,羟基酪醇的得率⁷0%,羟基酪醇的平均浓度在¹.9 g/L。通过三种载体的对比,发现多孔陶瓷球与前两种有机材料相比,价格低廉、性能优越,是工业生产中理想的固定化载体,适合工业规模的生产。这项技术证明利用固定化的纤维素酶从橄榄苦苷提取物中生物催化制备羟基酪醇在长期的工艺中是可行性。⑸六种不同的大孔树脂静态吸附、解吸羟基酪醇酶解液的研究表明,NKA-Ⅱ为羟基酪醇分离纯化的最佳大孔树脂。羟基酪醇原酶水解液、大孔树脂分离后、制备液相C₁₈色谱柱纯化后,样品的总酚含量分别为8.05%、35.72%、91.14%,样品中羟基酪醇的纯度分别为4.76%、21.17%、82.25%。经过大孔树脂和制备液相C₁₈色谱柱两步分离纯化后,羟基酪醇的纯度相对于原酶水解液纯化了17.28倍。⑹橄榄苦苷和羟基酪醇在酸性和弱碱的条件下,相对较稳定。在常用的加工温度50 ^oC⁹0 ^oC的条件下,橄榄苦苷和羟基酪醇并没有发生非常显著的变化。橄榄苦苷和羟基酪醇对日光灯、紫外灯影响不大,比较稳定;低温条件下保存更好。当浓度为0.03 mg/m L时,橄榄苦苷、羟基酪醇、Vc的总抗氧化能力分别为40.28%、71%、36.63%。羟基酪醇溶液的总抗氧化能力、总还原能力、DPPH自由基的清除能力比橄榄苦苷提取液和Vc表现出明显的优势,羟基酪醇溶液表现出更强的抗氧化性,橄榄苦苷提取液与Vc的抗氧化性接近。