背景与目的大肠癌（colorectal carcinoma，CRC）是全球的第三大常见肿瘤。大肠癌发病率逐年增高，且死亡率在所有消化道肿瘤中上升最快。大肠癌环绕肠一周约需要1.5年，快的增长率是导致其生存率降低的主要原因之一，抑制癌的增殖促进其凋亡可达到降低死亡率的目的。目前研究认为癌症的发生大多与抑癌基因的失活，癌基因的缺失、突变等引起的激活有关。有效的敲除与癌密切相关的基因的表达可望降低肿瘤的发生率。干扰技术作为一种从反向研究基因特别是癌基因的生物学作用，已经被用到基因的信号转导方面。丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）有P13K信号通路、P38信号通路和ERK1／2信号通路，而ERK信号通路是目前研究最为活跃的信号传导通路之一，研究认为该通路参与了细胞增长、发育、增殖、分化和细胞恶性转化等多种生理、病理过程。GAL-3是动物血凝素Lectins14个家族成员之一，目前研究认为在多种细胞，包括上皮细胞、肿瘤细胞、成纤维细胞以及淋巴细胞等中均有不同程度的表达，同时可在细胞膜、细胞间质、细胞基质及细胞核等部位表达，这提示GAL-3具有多种细胞生物学功能：细胞黏附、增殖、凋亡、细胞内剪接，这些功能的发挥借助于其C-末端的碳氢识别位点与相应的配体的结合促使Galectin-3构象发生改变。总结所有对GAL-3的研究发现：（1）GAL-3在大肠癌中表达与肿瘤的分化程度有关，分化程度越高，其表达量越低，相反分化程度越低，其表达量越高；（2）GAL-3在大肠癌中的表达与肿瘤的转移有关；（3）GAL-3在正常大肠组织中定位在细胞核，在从正常组织-重度不典型增生-癌变的过程中，GAL-3逐步向细胞浆分泌；因此GAL-3在大肠癌中的表达被认为与大肠癌发展关系比较密切；（4）有报道认为GAL-3在大肠癌血清中的高表达可以使它作为大肠癌普查筛选的一个有效指标。目前对GAL-3的研究主要集中在基质黏附转移以及凋亡方面的研究，对细胞增殖和分化的研究较少；此外GAL-3在大肠癌中的研究报道较少，且存在争议、作用机制不清。因此本实验有必要进一步验证GAL-3在大肠癌细胞中的表达并对其增殖的生物学作用进行机制的研究。本实验首先通过RT-PCR和免疫印记试验在基因和蛋白水平验证GAL-3在不同Ducks分期大肠癌细胞中的表达及免疫细胞化学进行细胞表达定位，并筛选出高表达的大肠癌细胞系；化学合成GAL-3siRNA并转染高表达的LoVo细胞株，用免疫印记对GAL-3siRNA进行有效小干扰片断的筛选，MTT法检测在干扰前后大肠癌细胞的增殖，流式细胞仪检测干扰前后细胞凋亡和细胞周期。随后根据上面筛选出的有效GAL-3siRNA进行合成pGPU6／GAL-3shRNA真核干扰重组表达载体建立稳定的GAL-3干扰细胞系。通过免疫印记检测ERK1／2、phospho-ERK1／2、MEK1、phospho-MEK1及上游信号蛋白K-Ras和PKC的检测，下游核转录因子C-myc的表达，探讨GAL-3可能参与大肠癌细胞增殖的信号通路。最后通过裸鼠体内接种转染有pGPU6／GAL-3shRNA的LoVo细胞和直接接种LoVo细胞成瘤后进行瘤体大小、浸润深度等的比较来进一步验证GAL-3在大肠癌中表达与增殖的关系。材料与方法一、GAL-3在不同Ducks分期大肠癌细胞中的差异表达和细胞内定位研究RT-PCR方法和免疫印记方法验证GAL-3在大肠癌细胞中的表达，免疫细胞化学对其进行细胞内定位。以NIH3T3人类成纤维细胞和胃癌SGL7901细胞作为阳性对照组，人胚肾T淋巴细胞HT293作为阴性对照组，根据NCBI上NM-002306序列合成GAL-3引物，并以β-actin作为内参，RT-PCR和免疫印记结果用凝胶灰度分析仪分析各组细胞的相对灰度值，比较各组细胞之间的差异，从基因水平和蛋白水平筛选出高表达GAL-3的细胞株；用免疫细胞化学观察GAL-3在大肠癌细胞中的表达部位。二、GAL-3在大肠癌细胞中的表达与大肠癌细胞增殖、凋亡和细胞周期的关系1、GAL-3有效干扰片断的合成及筛选根据Ambio公司在线设计软件设计并合成4对GAL-3 siRNAs（small interference RNAs）和一对与Galectin-3序列无关的RNAi命名为GAL-3siRNA-NC作为阴性对照组，瞬时转染LoVo细胞72h后提取细胞胞浆蛋白，免疫印记结果进行灰度分析筛选出能显著导致GAL-3基因沉默的有效的小干扰片断。2、MTT法检测GAL-3与大肠癌细胞增殖的关系。试验分LoVo、GAL-3siRNA—NC和GAL-3siRNA三组。按每孔约4000个LoVo细胞接种在96孔板中，根据上面筛选出的有效GAL-3siRNA，瞬时转染LoVo细胞后分别在24h、48h、72h处理细胞，用酶标仪测定各孔吸光度（A）值。每组试验重复三次。3、流式细胞仪检测GAL-3与大肠癌细胞凋亡和细胞周期的关系。采用Annexin-V-EGFP细胞凋亡双染试剂盒检测GAL-3在上述三组细胞中的凋亡情况，并检测干扰后细胞周期的改变以及荧光显微镜观察细胞凋亡。三、GAL-3参与大肠癌细胞增殖的信号转导通路研究1、p-GAL-3shRNA有效真核重组表达载体的构建及鉴定。p-GAL-3shRNA重组载体构建根据第二部分筛选出的有效GAL-3siRNA以及真核干扰载体pGPU6／GFP／Neo的结构合成1对并确定两端分别带有BbsⅠ和BamHⅠ酶切位点的shRNAs（short hairpin RNAs）单链，退火复性合成双链，BamHⅠ，HindⅢ和PstⅠ分别酶切鉴定，电泳和测序验证p-GAL-3shRNAR重组载体。细胞转染采用Invintrogen公司的Lipofectamine 2000^TM脂质体进行细胞转染。细胞转染48h后用800μg／ml G418筛选阳性P-GAL-3shRNA和p-LoVo细胞克隆并扩增培养。RT-PCR和免疫印记鉴定p-GAL-3shRNAR重组载体转染LoVo后抑制了GAL-3的表达，免疫荧光纤维镜鉴定转染效率。2、ERK1／2、phospho-ERK1／2、MEK1、phospho-MEK1、K-Ras、PKC等信号蛋白及下游核转录因子c-myc在转染P-GAL-3shRNA前后的表达变化。细胞浆蛋白提取及浓度测定同上，免疫印记方法首先检测信号蛋白ERK1／2、磷酸化的ERK1／2，MEK1及磷酸化的MEK1在干扰前后蛋白水平的变化，随后检测其上游信号蛋白K-Ras和PKC的表达情况，再检测下游转录因子c-myc在干扰前后的表达情况。初步明确PKC／K-Ras／MEK1／ERK1／2信号通路是否参与了GAL-3在大肠癌细胞中的增殖调控作用，并启动了下游C-myc核转录因子，从而引起大肠癌LoVo细胞的增殖。四、裸鼠成瘤实验15只BALB／c裸鼠（5-6周龄）随即分为三组，每组5只，背部皮下接种大肠癌肿瘤细胞后，观察GAL-3表达对LoVo细胞裸鼠成瘤的影响，包括成瘤瘤体重量、局部侵袭及远处转移部位差异。HE染色观察瘤体及肝脏和脾脏有无转移。五统计学处理数据以（?）±s表示，采用SPSS10.0统计软件单因素方差分析（one-way ANOVA）进行统计学处理，细胞增殖和凋亡采用重复测量数据的方差分析，裸鼠瘤体重量的比较采用随机单位组设计资料的方差分析，组间比较采用Bonferrori法，以P≤0.05为差异具显著性。结果：一、GAL-3主要表达在大肠癌细胞浆，在NIH3T3细胞、HT293细胞、SGL7901细胞及四种Ducks分期分别为A期SW1116，B期SW480，D期SW620和LoVo中的大肠癌细胞中，与β-actin的相对灰度比值在mRNA水平分别为0.969±0.05、0.504±0.02、0.986±0.01、0.589±0.09、0.624±0.06、0.843±0.01、1.258±0.01，组间比较，F=268138.2，P=0.000，各组两两比较，P均小于0.05，有显著统计学意义：在蛋白水平表达分别为1.634±0.017、0.616±0.01、1.435±0.01、0.978±0.01、0.999±0.06、1.228±0.06、2.051±0.01。组间比较，F=942152.0，P=0.000，各组两两比较，P均小于0.05，有显著统计学意义；从基因和蛋白水平均表明，GAL-3在四种大肠癌细胞中均有表达，其中在SW1116细胞中表达较弱，在LoVo表达最强。二、用瞬时转染的方法成功转染了GAL-3siRNA—676、GAL-3siRNA—737、GAL-3siRNA—208和GAL-3siRNA—433，免疫印记结果中与β-actin灰度值分别为0.883±0.02、0.597±0.10、0.07±0.02、0.09±0.03，组间比较F=977.544，P=0.000。根据干扰片断筛选原则GAL-3siRNA—433被作为最有效的干扰片断。瞬时转染此片断，分别在干扰后24h、48h、72h检测细胞增殖情况，发现LoVo组、GAL-3siRNA-NC组和GAL-3siRNA组细胞随着时间的延长均增殖明显，每组细胞在三个不同的时间段比较差异均具有显著性（P＜0.005）；在每一个时间段三组细胞比较，均有显著的统计学意义（P＜0.005），但LoVo组和GAL-3siRNA-NC组在各时间段比较差异无显著性（P＞0.005）。用流式细胞仪检测细胞周期和凋亡发现，干扰后细胞被阻滞在G1期，GAL-3在细胞各期都有凋亡，凋亡早期多于中晚期，但两组比较，同组细胞在不同细胞周期中P值分别为0.281、0.262、0.171，差异均无显著性；在细胞早期和细胞中晚期中，三组细胞组间比较F=268.785，30.726，P=0.000，0.004，说明组间比较差异显著。LoVo组与GAL-3siRNA-NC组在上述两个细胞周期比较差异无显著性（P＞0.005）。三、重组载体进行酶切鉴定，测序和序列比对，证实载体构建成功。pGUP6／GAL-3shRNA重组载体转染LoVo细胞48h后荧光纤维镜显示绿色荧光，从基因水平和蛋白水平两方面研究发现，与LoVo组和P-LoVo组相比，转染p-GAL-3shRNA组的细胞GAL-3的表达受到明显抑制（P均＜0.05）。从上述两方面证实转染成功，同时证明pGUP6／GAL-3shRNA干扰片断能明显导致GAL-3基因沉默。干扰后细胞信号蛋白的检测发现ERK1／2激酶和MEK1激酶在上述三组细胞中均有表达，phospho-ERK1／2和phospho-MEK1在P-GAL-3shRNA组与LoVo和p—LoVo比较表达明显减低，（P＜0.05）。PKC和K-Ras蛋白在干扰组表达与其余两组比较，表达明显降低（P＜0.05），c-myc在干扰组与余两组比较，表达也明显降低（P＜0.05），各组比较差异显著。四、裸鼠成瘤试验裸鼠皮下接种成瘤实验发现接种LoVo、p-LoVo和p-GAL3-LoVo细胞瘤体重量（g）分别为0.550±0.022、0.524±0.022和0.0887±0.022（P=0.001），组织病理学证实均为低分化腺癌，未发现局部淋巴结转移，对肝脏和脾脏行HE染色无癌细胞浸润。全文结论：一、GAL-3在大肠癌细胞中主要表达在细胞胞浆，在Ducks分期分别为A→D期的四种大肠癌细胞SW1116、SW480、SW620、LoVo中，在SW1116中表达较弱，在LoVo中表达最强。二、根据干扰片断的设计原则和RT-PCR及免疫印记试验结果，GAL-3siRNA-433被筛选出作为最有效的小干扰片断；GAL-3在大肠癌中的表达可能是在细胞周期的G1期通过促进细胞的增殖，抑制细胞的凋亡来调控细胞的生物学行为。三、PKC／Ras／ERK1／2 signaling pathway参与了GAL-3在大肠癌LoVo中的信号转导调控，并启动了下游细胞核内的c-myc转录因子，从而引起对大肠癌细胞增殖的调控。四、通过把p-GAL-3shRNA和LoVo及p-LoVo进行裸鼠皮下接种成瘤实验证实了干扰后瘤体重量与未干扰组相比有明显减轻，说明GAL-3基因沉默能显著抑制肿瘤的生长。