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20世纪70年代,Folkman首先提出“肿瘤的生长和转移都依赖于新生血管的生成”的论点。新生血管的形成是通过内皮细胞的增殖和迁移,从已有的毛细血管周围生成新的毛细血管的过程,其可发生在胚胎发育时期、子宫内膜周期性变化、损伤后修复和肿瘤生长等方面。血管新生主要受一系列促血管形成因子和抑制血管形成因子的双重调控,一旦这些调控因子的平衡被打破,就可能导致不正常的血管新生,引起肿瘤的生长和侵袭、心肌梗塞和糖尿病等疾病。目前已经证实:原发性肿瘤的生长及侵入其他周围组织器官都需要新生血管提供其营养支持,如果没有新生血管提供这些充足营养,一个肿瘤病灶在尺寸上不可能超过几毫米。因此,如果抑制肿瘤组织内新生血管的形成,肿瘤细胞将发生凋亡或坏死,从而抑制肿瘤的生长和转移,这就为抗肿瘤的治疗提供了一条新思路。目前,在已经发现的内源性血管形成抑制因子中,单链的高分子量激肽原（high molecular weight kininogen,HK）是血浆中一种多功能的糖蛋白,与血液凝固、补体反应及炎症发生等密切相关。在结构上,HK由六个结构域组成,其中D1、D2和D3区组成它的重链;D5和D6区组成它的轻链;重链和轻链之间是由包含有一个九肽的缓激肽的D4区相连。在血浆的激肽释放酶的作用下,单链的HK释放出含D4区的缓激肽后就形成了双链的HK即活化型高分子量激肽原（cleaved high molecular weight kininogen, HKa）。HKa由含D1、D2、D3的重链和含D5、D6的轻链组成,重链和轻链之间由一个单独的二硫键连接。HK活化为HKa的过程中,产生了较大的构象变化,从而使其第五结构域（D5）暴露的更加明显,研究已发现:HKa轻链富含组氨酸区域（histidine-rich domain,HRD）,即D5区是HKa抗细胞伸展的活性区域,也是HKa抑制血管生成的活性区域。GUO等发现HKa和D5区通过裂解与内皮细胞膜上尿激酶型纤溶酶原活化物受体（μPAR）结合启动的信号通路,从而使活化的内皮细胞去黏附而诱导内皮细胞凋亡来抑制血管的新生,因此,HKa的第五结构域（HKD5）具有潜在的抗肿瘤活性。近年来在对HKD5区发挥抑制活性的核心氨基酸序列的研究中,Zhang将D5区的384-503位氨基酸片段合成了14个多肽片段,每段多肽片段都是由16个氨基酸组成,结果发现:多肽HKD5 480-495、HKD5 488-503肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand,TRAIL）,又称凋亡素2配体（apoptotin-2 ligand,Apo-2L）是肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor,TNF）超家族成员之一,可形成编码的蛋白质TRAIL由281个氨基酸组成。TRAIL能选择性诱导肿瘤细胞凋亡,但对正常组织细胞对内皮细胞的增殖抑制作用最为显著。无明显损伤。其N-端第114-281位氨基酸片段是其核心序列,发挥TRAIL的主要功能,并可形成游离的可溶性蛋白。通过动物实验显示:单纯使用HKa或TRAIL抗肿瘤会存在用药剂量较大、起效时间长等问题,因此,本课题将以抑制肿瘤血管生长的HKD5发挥活性的多肽片段和诱导肿瘤细胞凋亡的TRAIL的活性片段进行融合,得到具有双功能作用的融合蛋白,即特异性的杀伤肿瘤细胞和抑制肿瘤组织内新生血管,从而提高其抗肿瘤活性。本课题运用基因工程技术,以编码一个甘氨酸的核酸序列作为连接臂,将HKD5480-495、HKD5488-503多肽的编码序列与TRAIL114-281编码序列融合,克隆表达得到重组蛋白MBP-HKD5480-495-TRAIL114-281和MBP-HKD5488-503-TRAIL114-281,并将得到的这两个融合蛋白进行生物学活性鉴定,发现MBP-HKD5480-495-TRAIL114-281一、HKD5具有更强的杀伤肿瘤细胞和抑制内皮细胞增殖和迁移的作用,在此基础上对HKa D5区抑制肿瘤细胞的分子机制进行初步探讨。480-495-TRAIL114-281、HKD5488-503-TRAIL114-281我们合成包含HKD5的克隆、表达及纯化480-495、HKD5488-503多肽的编码序列的引物,采用PCR技术用甘氨酸作为连接臂与TRAIL114-281编码序列融合,将两段融合序列分别插入到原核表达载体pMAL-c2中,获得重组表达质粒pMAL-HKD5480-495-TRAIL114-281和pMAL-HKD5488-503-TRAIL114-281,转化E.coli BL21（DE3）。经IPTG诱导表达,细菌破碎上清,行Amylose Resin亲和层析,过滤,-80℃保存备用。融合蛋白MBP-HKD5480-495-TRAIL和MBP-HKD5488-503在上述过程中,我们利用原核表达系统制备融合蛋白时,常选用大肠杆菌作为表达宿主,其转化和表达效率高、能大规模发酵培养,并且易于操作,可以快速生产重组蛋白。实验中选用的pMAL原核融合表达与纯化系统,该系统的表达质粒pMAL-c2x具有可调控的Ptac强启动子和翻译起始信号麦芽糖结合蛋白（MBP）,对于一般的外源蛋白都能高水平表达融合蛋白。系统含有一步亲和层析纯化表达产物的标签蛋白MBP,有利于重组蛋白正确折叠,因此能有效的提高表达目的蛋白的可溶性。-TRAIL在E.coli BL21中表达量占细菌总蛋白的20%以上,诱导后得到了有效的表达,超声破菌后,融合蛋白主要在上清表达,经Amylose Resin亲和柱纯化后的重组蛋白达到电泳纯。SDS-PAGE分析显示,IPTG诱导后可表达相对分子质量为61KDa的两个目的蛋白。经Western Blot鉴定在61KDa处得到相应的融合蛋白表达条带。二、融合蛋白MBP-HKD5480-495-TRAIL114-281和MBP-HKD5488-503-TRAIL114-281的生物学活性研究纯化后的融合蛋白作用于人脐静脉内皮细胞HUVEC表现出抑制内皮细胞增殖的作用。聚碳酸酯膜小室趋化运动模型（Transwell小室）检测:融合蛋白能够有效抑制HUVEC细胞的迁移,其抑制效果与浓度呈正相关。在对人大细胞肺癌NCI-H460细胞和人胰腺导管上皮细胞癌SW1990细胞的细胞毒实验发现:MBP-HKD5480-495-TRAIL、MBP-HKD5488-503-TRAIL对肿瘤细胞的杀伤效果较单独使用TRAIL和HKD5480-495多肽、HKD5488-503多肽更加显著。我们进一步通过流式细胞检测:证实了融合蛋白可以明显的诱导NCI-H460细胞凋亡。通过上述对融合蛋白的生物学活性研究中,我们发现:与MBP-HKD5488-503-TRAIL相比,MBP-HKD5480-495本研究在原核表达系统中高效表达出了融合蛋白MBP-HKD5-TRAIL具有更加显著抑制内皮细胞的增殖和迁移作用以及对肿瘤细胞的凋亡作用都更加显著。480-495-TRAIL和MBP-HKD5488-503-TRAIL,纯化后的蛋白作用于内皮细胞表现出抑制内皮细胞增殖、迁移的作用。在体外能杀伤人大细胞肺癌NCI-H460细胞、人胰腺导管上皮细胞癌1990株细胞,并且能诱导肿瘤细胞凋亡,表现出融合蛋白具有良好的双功能活性。融合蛋白既具有TRAIL的抗肿瘤活性,又具有对内皮细胞特异性地抑制作用,从而为这两个融合蛋白作为抗肿瘤候选分子打下了基础。