异种核移植可能成为保护高度濒危动物,建立治疗性克隆非人灵长类动物模型和核质互作关系研究动物模型的一种有效方法。可以避免人类治疗性克隆研究中的伦理、法律和临床上的实验限制。本研究利用核移植技术,将食蟹猴耳部皮肤成纤维细胞融于去核猪卵母细胞中,经融合和活化后,体外培养,并进行了相关的研究。1.应用组织块培养法从年龄4岁的雄性食蟹猴耳皮肤进行原代和传代培养,成功建立了耳缘组织成纤维细胞系。单个细胞均为典型梭形细胞,抗波形蛋白免疫荧光染色显示为阳性,抗角形蛋白免疫荧光染色为阴性,分离到的细胞为耳部成纤维细胞,免疫细胞化学分析了培养细胞的微管蛋白表达情况,结果显示培养细胞具有良好的细胞骨架系统,从另一侧面反映了培养条件比较适合于食蟹猴耳成纤维细胞的生长。绘制的细胞生长曲线呈“S”型,细胞生长经历了潜伏期、指数生长期和停滞期,符合体外细胞生长规律。该成纤维细胞染色体数2n=42,并分析了5、10、30代染色体数,2n所站的比率分别为90.16%、86.20%、83.07%。用含10%FBS和10%DMSO的DMEM为冷冻液,解冻后细胞活率经FDA/PI染色检测,细胞活率都在93%以上,传代后细胞生长速度和形态没有明显变化。细菌、真菌污染检测结果：接种单层细胞的液体培养基和阴性对照一样,没有混浊或其它变化；病毒检测结果,红细胞吸附实验结果为阴性；支原体检测结果,实验采用了Hoechst33258荧光染色法,未检查到细胞被支原体污染。乳酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶同工酶电泳图谱正常,没有交叉污染。食蟹猴耳部成纤维细胞转染绿色和红色荧光蛋白质粒的效率分别为8.12%和12.35%。微量保存食蟹猴耳部皮肤成纤维细胞是一种可行的办法。2.供体核与受体胞质细胞周期同步与否是影响克隆胚胎发育以及克隆成功的重要因素之一。我们用几种方法调控食蟹猴耳皮肤成纤维细胞细胞周期,以期获得高比例的G0/G1期细胞。细胞经固定、染色后用流式细胞仪(FACS)分析细胞周期分布,Hoechst33342染色评价细胞凋亡水平。实验1研究了血清饥饿、接触抑制处理1、3、5天和正常培养对各细胞周期分布的影响；实验2分析不同的抗氧化剂(β-巯基乙醇10mM；半胱氨酸2mM)处理4、24小时对细胞周期分布的影响;实验3中研究三个蛋白酶抑制剂(6-DMAP2mM; CHX7.5mg/ml; CB7.5mg/ml)分别处理不同时间对细胞周期分布的影响；实验4中研究15μM Roscovitine处理24、48、72小时用FCS分析细胞周期分布；实验5比较不同浓度DMSO(0%,0.5%,1.0%and2.5%)处理4和24小时对细胞周期分布和细胞凋亡的影响。血清饥饿和接触抑制都可以提高GO/G1期细胞比率,显著高于对照组(67.52%)(p<0.05)。10mMβ-巯基乙醇处理24小时可以显著提高G0/G1期细胞比率(82.04%)差异显著(p<0.05),2mM半胱氨酸处理24小时G0/G1期细胞比率为84.66%差异显著。6-DMAP, CB处理24小时相对于对照组可以显著提高G0/G1期细胞比率,G0/G1期细胞比率分别为71.26%,79.89%。CHX处理24小时和48小时均显著提高G0/G1期细胞比率,数值分别为79.72%和97.94%。15μM Roscovitine处理24、48和72小时GO/G1期细胞比率分别为76.51%,89.69%。90.49%,其中48小时和72小时处理组显著高于24小时处理组和对照组(p<0.05)。1.5%and2.0%DMSO处理4小时(82.86%,86.31%)G0/G1期细胞比率显著(p<0.05)高于其它4小时(0.5%DMSO for78.84%,1.0%DMSO for78.65%)处理组和对照组(67.52%)。1%(90.45%%),1.5%(91.57%) and2.0%DMSO (98.68%)处理24小时比0.5%DMSO (78.22%)对照组(67.52%)获得较好的同期化效果(p<0.05)。对照组有4.63%的细胞凋亡,1.5%、2%DMSO处理4小时,1%、1.5%、2%DMSO处理24h导致细胞发生凋亡的比率分别为10.52%,12.75%,10.42%,12.75%,17.07%。2%DMSO处理24小时可以有效的提高G0/G1期细胞比率,同时也增加了细胞凋亡的比率(p<0.05)。3.供体细胞在受体卵胞质中DNA不完全甲基化重编程是导致克隆胚胎发育失败的主要原因。5-脱氧杂氮胞苷(5-azaC)为一种胞嘧啶核苷类似物,在DNA复制过程中可以与DNA甲基转移酶(DNMT)结合形成一种共价复合物,抑制该酶的甲基转移活性,而达到去甲基化的作用。本研究检测不同浓度的5-脱氧杂氮胞苷对食蟹猴耳部成纤维细胞的增殖、核型、凋亡及细胞周期的影响。我们用0.08、0.31、1.25、5μ M5-azaC处理食蟹猴成纤维细胞,随着5-azaC浓度的增加细胞形态明显改变,当5-azaC浓度达到5μM时,细胞形态明显改变,细胞形态不再是典型的梭状,不再饱满,变得扁平,所有的药物处理都会抑制细胞的生长,1.25μM和5μ M5-azaC处理组的生长速度比其它组要慢,0.08μM和0.31μM处理组更接近没有药物处理组的细胞生长特征。用FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit Ⅰ试剂盒染色,流式细胞仪检测各处理组96h的凋亡情况,各处理组早期凋亡比例都比对照组要高(Oμ M:2.52%,0.08μM:6.91%,0.31μM:8.39%,1.25μM:8.61%,5μM:8.93%),5-azaC处理食蟹猴成纤维细胞96小时可以引起细胞的早期凋亡,5μM5-aza处理细胞表现出高的晚期凋亡和坏死,显著高于其它各组,0.08.0.31、1.25p M5-azaC可以导致细胞的晚期凋亡和坏死,显著高于对照组(OμM:7.71%,0.08μM:12.47%,0.31μM:13.72%,1.25μM:14.18%,5μM:24.98%)。不同浓度5-azaC处理96小时后的细胞染色体数目,在对照组和0.08、0.31μM5-azaC处理组,大于81%的细胞是二倍体,0.08μM和0.31μM5-azaC与对照组差异不显著,1.25μM5-azaC (76.6%)和5μM5-azaC (68.8%)处理组二倍体下降,显著高于对照组(87.3%)。流式细胞仪检测5-azaC处理96小时细胞周期,5-azaC各浓度处理没有对细胞周期产生明显影响。随着5-azaC浓度的增加,处理细胞的甲基化水平有所下降,其中0.31、1.25、5μM5-azaC处理组要显著低于0.08μM5-azaC处理组和对照组。4.TSA是一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂,TSA可以通过抑制组蛋白去乙酰化酶的作用从而使染色质处于超乙酰化状态,激活发育相关基因,利用TSA处理核移植的供体细胞,可以提高克隆胚胎的发育。本研究的目的在于采选最佳的TSA浓度用以食蟹猴体细胞核移植的相关研究。不同浓度TSA对食蟹猴耳部皮肤成纤维细胞增殖均有抑制作用,0.08μM和0.1μM TSA比其它各组的增殖要慢,形态有所改变。不同浓度TSA对食蟹猴耳部皮肤成纤维细胞的凋亡成剂量依赖模式。TSA处理组的凋亡率分别为3.38±0.12%(OμM),4.04±0.11%(0.01μM),5.13±0.29%(0.03μM),6.75±0.45%(0.05μM),9.95±0.78%(0.08μM),12.55±0.65%(0.1μM),对照组与0.01μMTSA和0.03μMTSA处理组差异不显著(P>0.05),0.08μM TSA和0.1μM TSA显著高于对照组、0.01μM TSA、0.03μM TSA处理组差异显著(P<0.05)。TSA对食蟹猴耳部成纤维细胞细胞周期分布的影响,高浓度的TSA (0.1μM)可以提高GO/G1期细胞比率,与其它各处理组及对照组差异显著(P<0.05)。不同浓度TSA对食蟹猴耳部成纤维细胞染色体倍性的影响。随着TSA浓度的增大,2n所占比率有所下降,至0.08和0.1μM,2n所占的比率与其它各组差异显著(P<0.05)。随着TSA浓度的增大,处理细胞的乙酰化水平增高,所有药物处理组都要高于对照组。5.利用核移植技术,将食蟹猴耳部皮肤成纤维细胞融于去核猪卵母细胞中,经融合和活化后,体外培养,并进行了相关的研究。结果表明,TCM-199和NCSU-23对猪卵母细胞的体外成熟和卵丘扩展有相同的效果,44h和48h的卵母细胞的去核率为82.26%和81.36%,显著高于IVM60h卵的去核率(70.21%)。PZM-3培养猪胚胎的效果好于NCSU-23。在研究不同的电击参数试验中,1.4k V/cm,80μs,1DC处理组的死亡率显著高于其它两个参数(1.2k V/cm,30μs,2DC;2.0k V/cm,50μs,1DC)。猪同种核移植重构胚胎的融合参数适合食蟹猴-猪异种核移植重构胚胎的融合；猪卵子的去核胞质可以对食蟹猴耳部成纤维细胞核重新去分化。比较了同种核移植中不同供体细胞对重构胚胎发育能力的影响,三种供体细胞,发育到囊胚的比率分别为20.45%(猪胎儿成纤维细胞,),7.35%(猪卵丘颗粒细胞),5.95%(猪耳部皮肤成纤维细胞),胎儿成纤维细胞作为供体细胞得到了最高的发育率,显著高于耳部皮肤成纤维细胞和卵丘颗粒细胞为供核细胞的发育率,以食蟹猴耳部皮肤成纤维细胞做为供核细胞获得了8.67%的囊胚发育。以不同培养代数的细胞用作核移植供体,我们比较了1-3代,4-6代,7-10代食蟹猴耳部皮肤成纤维细胞作核移植供体,对异种重构胚的体外发育率没有显著的影响。用PZM-3或者HECM-9以及H和P按体积1：1混合,三种培养液发育至囊胚的比率分别为10.7%,8.7%和8.0%。在研究不同培养温度对异种重构胚胎发育的实验中：37℃,39℃(4D)+37℃,37℃(4D)+39℃三组发育至囊胚的比率分别为1.0%,0.3%,1.3%,显著低于39℃全程培养的结果(9.47%)。共培养没有提高异种重构胚胎的发育。15μMRoscovitine处理48小时体细胞可以提高同种(14.23%)和异种(15.05%)胚胎发育,显著高于对照组。用0.03μM TSA和0.31μM5-azaC处理食蟹猴耳部成纤维细胞96小时,检测胚胎发育的水平,对照组和0.03μM TSA和0.31μM5-azaC处理的囊胚发育分别为7.63%,8.54%,7.42%。6.在体细胞克隆中,线粒体主要来源于受体卵母细胞。然而在异种核移植中,由于核供体和胞质受体来源于两个遗传上关系较远的种或属,两种不同来源的线粒体DNA (mtDNA)在重构胚早期发育中的动态变化还不清楚。本文定量研究了猪卵胞质重编程的食蟹猴胚胎中食蟹猴和猪mtDNA的水平。实时定量PCR分析结果表明植入前克隆胚胎中两种来源的线粒体DNA共存,以猪卵胞质来源的mtDNA占主导。刚融合的1-细胞期单个重构卵中包含3.01×104拷贝的食蟹猴mtDNA,6.78×106拷贝的猪mtDNA。1-细胞、2-细胞,4-细胞,8-细胞,囊胚,食蟹猴mtDNA所占的比率分别为0.44%,0.82%,0.92%,1.19%,1.47%。随着异种重构胚的发育,两种来源的线粒体同一胚胎内都是非均匀分配的。