目的：　　心脏骤停(cardiac arrest，CA)是指各种原因引起的心脏射血突然停止，是致死和致残的主要原因。CA的发生率为20～140/10万，随着心肺复苏(cardiopulmonary resuscitation，CPR)技术的进步，约25％～40％的患者能恢复自主循环(retum of spontaneous circulation，ROSC)，但CA患者死亡率仍高达55～71％，即使存活的患者也常遗留严重的神经功能残疾。CA患者在恢复自主循坏后，由于缺血再灌注损害，使机体发生严重的应激反应，引起全身炎症反应综合症，并导致相应的多器官功能障碍，临床上表现为心脏骤停后综合症(post-cardiac arrest syndrome，PCAS)，其主要包括:1、CA后脑损害;2、心肌功能障碍;3、全身性缺血再灌注损伤;4、引起CA的原发病本身变化。由于脑组织对缺血缺氧的耐受性极低以及脑组织的易损性，使得CA后的脑损害表现最为突出，临床上我们称之为成人“缺血缺氧性脑病”(HIE)。CA/CPR导致脑损伤的机制十分复杂，其中严重的能量耗竭是CA后的主要特征之一，在缺血期，ATP合成减少导致线粒体膜电位下降和钙离子流入，从而导致神经元损伤。ROSC后再灌注引起氧自由基的过度生成，可直接损害细胞膜及促进炎症发生。目前唯一被证明有效的治疗手段是亚低温治疗，但亚低温的治疗时间窗窄及存在相关并发症，在临床上的运用仍非常有限。因此，探讨HIE后的脑损伤机制及有效的靶向神经保护剂对降低CA患者在恢复自主循环后的死亡率及致残率有重要的意义。　　AMP激活蛋白酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)是细胞的重要ATP/AMP能量感受蛋白，当糖供能量下降时，细胞可通过AMPK磷酸化产生p-AMPK，诱导脂肪代谢为细胞供能。一旦被激活，AMPK能通过多个下游路径，增加体内ATP水平。研究表明二甲双胍可激活脑内AMPK，通过维持细胞能量平衡、促进线粒体再生、增加脑源性神经营养因子(BDNF)的表达促进神经元的存活，从而在能量耗竭中发挥神经保护作用。作为AMPK下游重要的调控靶点一自噬，在长时程二甲双胍预处理后在CA/CPR诱导的HIE损伤中发挥何种作用尚未有所报道。基于以上研究背景，我们假设二甲双胍预处理可能通过激活AMPK诱导自噬激活，从而减轻CA/CPR引起的缺血性损伤。　　本研究的目的在于:(1)评估二甲双胍在大鼠窒息性心脏骤停/心肺复苏（asphyxial cardiac arrest/cardiopulmonary resucitaiton，ACA/CPR）模型的神经保护作用;(2)通过自噬的特异抑制剂干预前后比较，阐明自噬在CA/CPR诱导的脑损伤中的神经保护作用;(3)二甲双胍在HIE中对自噬的调节及其发挥神经保护的机制。　　方法：　　为达到上述研究目的，我们进行了以下三个部分的研究。具体研究方法和内容分别如下:　　一、二甲双胍在大鼠9分钟窒息性心脏骤停/心肺复苏(9-min ACA/CPR)模型的神经保护作用　　采用SD雄性大鼠随机分为二甲双胍组(Met)和对照组(Veh)，Met组给予浓度30mg/ml，200mg/kg剂量的二甲双胍连续灌胃14天，而Veh组灌等量的生理盐水。灌胃后24h分别进行9-min ACA/CPR造模和假手术处理。　　对对照组(n=20)、二甲双胍组(n=20)以及假手术组(n=5)的大鼠进行7d生存率、神经功能以及病理学损伤评估。利用改良NDS评分量表（0分表示脑死亡，80分表示没有神经功能缺损）评估各组大鼠的神经功能缺损评分;尼氏染色观察大鼠海马CA1区神经元丢失情况;利用免疫组化方法对病理损伤进行评估，分别观察神经元树突(microtubule associated protein，MAP2)、小胶质细胞(ionized calcium bindingadaptor molecule-1，Iba-1)以及星形胶质细胞(glial fibrillary acidic portein，GFAP)相应的表面标志物在各组的表达情况。　　二、观察自噬及AMPK在9-min ACA/CPR后的激活情况　　第一部分，ROSC后各个时间点(6h，12h，24h，48h)分别提取二甲双胍组及对照组大脑皮层和海马蛋白，Westem blotting法检测自噬相关蛋白(LC3，p62)及AMPK，p-AMPK蛋白在各组表达水平。第二部分，在ROSC后24h处死大鼠并取脑，随后观察大鼠免疫荧光染色及透射电镜指标，评估各组的自噬表达水平。　　三、观察长时程二甲双胍预处理对9-min ACA/CPR模型的神经保护作用机制　　通过自噬抑制剂Chloriquine(CQ，25mg/kg,i.p.)、AMPK抑制剂Compound C(Cc，100nmol/rat，10μl，i.c.v.)干预前后比较，检测CA/CPR损伤后不同脑区（皮层、海马）自噬相关指标及自噬体，同时通过免疫组化法测定神经元树突丢失情况(MAP2)，尼氏染色测定神经元丢失及测定动物神经行为功能，评估二甲双胍治疗对自噬的调节作用及其发挥神经保护的机制。　　结果：　　一、二甲双胍显著改善9-min ACA/CPR大鼠的7d生存率和神经功能缺损　　对照组大鼠的7d累积生存率为55％(11/20)，而二甲双胍组为85％(17/20)，两组相比有统计学差异(x2=4.164，P=0.0413)。ACA/CPR造模后二甲双胍组大鼠在24h、48h和72h的NDS评分与对照组相比，均显著增高（均P＜0.05）。Met给药可显著降低7天海马CA1区存活神经元丢失(P＜0.05)及树突丢失(P＜0.05)。ACA/CPR后大鼠的海马CA1区可见明显的小胶质细胞(Iba-1)和星形胶质细胞(GFAP)活化，Met可明显抑制星形胶质细胞和小胶质细胞的活化(P＜0.05)。此外，对照组在ROSC后24h海马CA1区Cleaved Caspase-3阳性细胞数明显增多，而Met组Cleaved Caspase-3免疫组化染色阳性的细胞数明显较少(P＜0.05)，表明二甲双胍预处理可抑制ACA/CPR诱导的神经元凋亡。　　二、9-min ACA/CPR后自噬及AMPK被激活，而Met进一步放大这种激活　　Western blotting表明ROSC后48h，AMPK明显被激活。而在Met组，AMPK激活最早出现在ROSC后6h，且持续升高到48h（P＜0.01）。此外，Met显著增加了CA/CPR诱导的p-AMPK的激活(P＜0.05)。同时，CA/CPR诱导自噬标记蛋白LC3-Ⅱ蛋白随时间变化的积累，LC3-Ⅱ蛋白水平从ROSC后12h开始增加，24及48h达高峰。p62蛋白表达水平从ROSC后12h开始降低，在24及48h进一步衰减。这些结果表明CA/CPR后12h自噬明显被激活，ROSC后24及48h自噬激活达高峰。Met预处理后，24h免疫荧光显示LC3-Ⅱ表达较对照组高(P＜0.01)。同时，电镜可观察到Met组与对照组自噬小体的形成。24及48h的western blotting结果表明Met组与对照组相比自噬进一步被激活（P＜0.05）。　　三、抑制自噬及AMPK后，二甲双胍的神经保护作用被逆转　　给予AMPK抑制剂Compound C(Cc)干预后，Met+Cc组大鼠海马、皮层的p-AMPK蛋白水平明显低于Met+Veh组。NDS评分结果表明，与Met+Veh组相比，Met+Cc组大鼠在ROSC后24h，48h及72h的NDS评分均明显降低（均P＜0.05），表明二甲双胍诱导的神经功能改善被Cc取消了。尼氏染色结果显示，Met+Cc组大鼠海马CA1区神经元数量明显低于Met+Veh组（P＜0.01）。另外，Met+Cc组大鼠海马CA1树突损伤较Met+Veh组更明显（P＜0.01）。给予自噬抑制剂Chloriquine(CQ)干预后，Met+CQ组相比Met+Veh组，western blotting结果显示大鼠海马及皮层的自噬被抑制(均P＜0.05)，同时NDS评分表明Met+CQ组大鼠在ROSC后24h，48h及72h的NDS评分均明显降低（均P＜0.05）。尼氏染色及MAP2染色进一步表明，与对照组相比，CQ明显减少了大鼠海马CA1区神经元数量并加重了树突损伤（均P＜0.01）。此外，Cc明显降低了大鼠在ROSC后24h海马及皮层的LC3-Ⅱ蛋白的表达水平，提示二甲双胍预处理在CA/CPR脑损伤中通过激活AMPK诱导自噬的进一步激活。　　结论：　　一、二甲双胍可以改善q-min ACA/CPR大鼠的7d生存率、神经功能评分以及海马CA1区的神经元丢失，抑制海马CA1区胶质细胞活化。　　二、二甲双胍可导致CA/CPR大鼠早期并持续的AMPK的激活;CA/CPR可促进自噬的激活，而二甲双胍预处理可进一步增强自噬的激活。　　三、AMPK或自噬的抑制取消了二甲双胍在CA/CPR大鼠的神经保护作用，且AMPK的抑制减少了二甲双胍诱导的自噬激活，提示二甲双胍这种神经保护作用是通过AMPK诱导自噬激活介导的。