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目的:痛风(gout)是与循环中尿酸过多导致单钠尿酸盐结晶沉积于组织有关的一种代谢性疾病。急性痛风性关节炎(Acute Gouty Arthritis,AGA)是单钠尿酸盐(MSU)结晶沉积于关节及周围组织,以炎性细胞浸润、关节肿胀和剧烈疼痛为主要临床特征的一种急性风湿性疾病。MSU晶体激活NLRP3炎性体,导致IL-1β分泌,随后刺激中性粒细胞细胞活化,TNF-α、IL-6等促炎细胞因子及炎症趋化因子释放,炎性细胞聚集于炎症部位,触发炎症级联反应。TGF-β1在急性痛风炎症的自行缓解中发挥了重要作用。目前急性痛风的治疗西医主要依靠秋水仙碱、非甾体类抗炎药、糖皮质激素及生物制剂等药物,但这些药物的应用或伴随严重毒副作用,或成本高昂。中医学对痛风的认识历史悠久,将其归为“痹证”范畴,临床采用传统辨证治疗急性痛风取得一定疗效,安全性良好,但存在作用较弱、起效较慢等问题。中药有效成分是传统中药的提取物,临床治疗炎性疾病获得较好疗效。本研究在现代中西医结合背景下,采用正交设计方法对预筛5种植物中药有效成分针对大鼠AGA模型筛选最优配伍组合,并进一步验证有效成分复方对AGA的治疗效应、探索抗炎相关作用机制,为开发快速、强效治疗痛风的现代中药有效成分复方制剂提供依据。方法:1正交t值法中药有效成分最佳配伍筛选1.1复方最佳药物组成筛选按照主效应筛选正交t值表的安排将SD大鼠随机分成12组,进行经正交t值表安排的复方药物灌胃,给药5天后踝关节腔注射MSU晶体制备AGA模型。另设空白对照组,服用0.9%氯化钠注射液,注射PBS作为阴性对照。造模前后测量踝关节周径计算其肿胀度。1.2复方中辅药交互作用分析按照辅药交互作用正交t值表的安排将SD大鼠随机分成4组,给予主药辅药复方,同时另设立模型组及空白对照组对疾病模型进行验证,给药5天后造模,测量踝关节周径计算其肿胀度。1.3复方药物最佳剂量配比筛选按照剂量筛选正交t值表的安排将SD大鼠随机分成9组,仍同时设立模型组及空白对照组对疾病模型进行验证,给药5天后造模,计算踝关节肿胀度。2有效成分复方对AGA大鼠的抗炎效应评价及血清、关节组织炎症相关因素检测分析将SD大鼠随机分为中药有效成分优选复方(Effective Components of the optimal Compound,ECC)组、秋水仙碱(Colchicine)组、模型(Model)组、正常对照(Control)组4组。模型组、正常对照组予等体积生理盐水,两治疗组给予相应药物灌胃5天。第6天除空白对照组外均制备AGA模型,空白对照组注射等量PBS液。观察各组大鼠肿胀度、肿胀率及步态,造模24小时后每组随机抽取8只采集血清及踝关节标本,剩余每组继续如前法给药,至造模后120小时采集剩余大鼠血清及踝关节标本。ELISA法检测血清中IL-1β、IL-6、TNF-α、MIF及TGF-β1的含量。踝关节标本脱钙后进行切片制备,HE染色观察关节滑膜病理学变化,免疫组化法检测踝关节滑膜组织中NLRP3、IL-1β、TGF-β1的表达,测定阳性表达物的平均光密度(MOD)进行半定量分析。3统计学方法所有数据用SPSS13.0软件包进行统计学处理,各组间比较采用重复测量或单因素方差分析,非正态资料及等级资料采用非参数检验,P<0.05认为具有统计学意义。结果:1正交t值法有效成分复方最佳配伍筛选经基于AGA大鼠关节炎症肿胀度的正交t值法筛选实验,发现4种植物中药有效成分抗炎效应的最佳配伍:青藤碱(Sinomenine,SN)高剂量、白芍总苷(Total glucosides of paeon,TGP)中剂量、三七总皂苷(Panax Notoginseng Saponins,PNS)低剂量及雷公藤多苷(Tripterygium Glycoside,TG)中剂量。2 ECC抗炎效应2.1 ECC炎症进展阶段抗炎效应2.1.1各组大鼠肿胀度变化ECC治疗组和秋水仙碱组大致相当(P>0.05),ECC治疗组、秋水仙碱组及AGA模型组肿胀度均于造模后8小时达到高峰,显著高于正常对照组(P<0.01),ECC治疗组和秋水仙碱组肿胀度则显著低于模型组(P<0.01),且ECC治疗组和秋水仙碱组肿胀度变化无明显差异(P>0.05)。2.1.2各组大鼠肿胀率变化ECC治疗组和秋水仙碱组相当(P>0.05),ECC治疗组、秋水仙碱组及AGA模型组肿胀率高于正常对照组(P<0.01),ECC治疗组和秋水仙碱组肿胀率则显著低于模型组(P<0.01)。2.1.3造模8小时后各组步态分级与正常对照组相比,其余三组AGA造模大鼠活动均有减低,表现为不同程度的造模下肢跛行,步态变化差异显著(P<0.01);ECC治疗组与模型组相比明显改善(P<0.01),秋水仙碱组亦有改善(P<0.05),而ECC治疗组与秋水仙碱组相当(P>0.05)。2.1.4各组血清细胞因子水平比较ECC治疗组和秋水仙碱组相比IL-1β水平有所减低(P<0.05),模型组与正常对照组相比则有显著升高(P<0.01);各组血清IL-6水平无显著性差异(P>0.05);ECC治疗组与模型组相比TNF-α水平明显降低(P<0.01),秋水仙碱组与正常对照组相比有所增高(P<0.05),模型组TNF-α水平最高,与正常对照组相比差异显著(P<0.01);与正常对照组相比,其余三组TGF-β1水平升高明显(P<0.01),ECC治疗组和秋水仙碱组相比显著增高(P<0.01),与模型组相比亦有明显增高(P<0.01);ECC治疗组与与模型组相比MIF水平显著降低(P<0.01),秋水仙碱组与模型组相比亦有减低(P<0.05),而模型组与正常对照组相比有所升高(P<0.05)。2.1.5各组踝关节滑膜组织病理变化HE染色可见模型组大量中性粒细胞等炎性细胞浸润,滑膜增厚,组织水肿,ECC治疗组和秋水仙碱组与模型组相比病理改变均有所改善,正常对照组无上述形态学异常。2.1.6各组踝关节滑膜组织IL-1β、TGF-β1、NLRP3的表达ECC治疗组、秋水仙碱组及模型组NLRP3的表达与正常对照组相比升高明显(P<0.01),ECC治疗组、秋水仙碱组与模型组相比NLRP3的表达减弱明显(P<0.01),同秋水仙碱组相比ECC治疗组的NLRP3表达更低(P<0.01);ECC治疗组、秋水仙碱组与模型组相比滑膜中IL-1β表达显著减低(P<0.01),而模型组与正常对照组相比则有明显增高(P<0.01);ECC治疗组、秋水仙碱组及模型组TGF-β1的表达与正常对照组相比升高明显(P<0.01),ECC治疗组、秋水仙碱组与模型组相比TGF-β1的表达显著减弱(P<0.01),ECC治疗组与秋水仙碱组组相比TGF-β1的表达则明显增强(P<0.01)。2.2 ECC炎症缓解阶段抗炎效应2.2.1各组大鼠肿胀度变化各组间踝关节肿胀度变化均存在显著差异(P<0.01),从造模后36小时开始ECC治疗组、秋水仙碱组及模型组肿胀度即明显减低,而正常对照组则相对平稳。造模后120小时ECC治疗组、秋水仙碱组肿胀度与正常对照组大致相当(P>0.05)。2.2.2各组大鼠肿胀率变化各组间踝关节肿胀率变化均差异明显(P<0.01),从变化趋势来看ECC治疗组、秋水仙碱组肿胀率显著低于模型组(P<0.01)。2.2.3各组血清IL-1β、IL-6、TNF-α、TGF-β1、MIF水平比较ECC治疗组、秋水仙碱组IL-1β水平均低于模型组,模型组则高于正常对照组(P<0.05);各组血清IL-6、TNF-α、MIF水平差异无统计学意义(P>0.05);ECC治疗组TGF-β1水平低于模型组(P<0.05),同模型组相比秋水仙碱组显著降低(P<0.01),模型组则明显高于正常对照组(P<0.01)。2.2.4各组踝关节滑膜病理变化模型组关节可见中性粒细胞等炎性细胞浸润,滑膜组织存在水肿;ECC治疗组、秋水仙碱组大鼠上述关节病理表现均有改善;正常对照组大鼠关节组织学无异常表现。2.2.5各组踝关节滑膜组织NLRP3、IL-1β、TGF-β1的表达ECC治疗组NLRP3的表达显著低于秋水仙碱组(P<0.01),同模型组相比ECC治疗组、秋水仙碱组明显表达减弱(P<0.01),ECC治疗组、秋水仙碱组及模型组NLRP3的表达则显著高于正常对照组(P<0.01);ECC治疗组、秋水仙碱组IL-1β的表达显著低于模型组(P<0.01),而模型组与正常对照组相比明显增高(P<0.01);ECC治疗组TGF-β1的表达明显高于秋水仙碱组和正常对照组(P<0.01),与模型组相比TGF-β1的表达ECC治疗组显著升高(P<0.01),秋水仙碱组则明显低于模型组(P<0.01),与正常对照组相比模型组TGF-β1的表达显著增强(P<0.01)。结论:1经正交t值法针对AGA大鼠模型抗炎筛选,发现4种植物中药有效成分抗炎作用最佳配伍为:青藤碱高剂量、雷公藤多苷中剂量、白芍总苷中剂量、三七总皂苷低剂量。2中药有效成分复方可显著抑制AGA大鼠关节肿胀,并可改善关节组织病理学变化。3中药有效成分复方针对AGA的可能抗炎机制:抑制关节组织NLRP3炎性体表达,下调血清或关节IL-1β、TNF-α、MIF等促炎细胞因子并上调保护性细胞因子TGF-β1表达。