第一部分 问号钩端螺旋体赖型IPAV 株全基因组测序 钩端螺旋体(Leptospira，简称钩体)是具有独特形态结构、特殊进化地位的一类革兰阴性菌。致病性钩体可引起钩体病，具有重要的医学意义。 2003 年，我们研究组完成了致病性问号钩体赖型＃56601 株全基因组测序。经几年的功能基因组研究，目前还尚未找到其致病的关键因素。 在这种背景下，我们决定对无致病性的问号钩体赖型IPAV 株进行全基因组测序，并通过基因组的比较分析来揭示＃56601 株致病的分子基础。 本课题采用最新的pyrosequencing 测序法和传统的双脱氧末端终止法(Sanger 法)相结合的策略，对问号钩体赖型IPAV 株进行全基因组测序。整个测序过程分为三个阶段。首先，以Genome Sequencer 20 System(GS20，454 Life Sciences )进行大规模测序。共得到872719 条高质量的序列读长(reads)，达基因组17 倍覆盖率(coverage)，经软件直接拼装(denovo assembly)，生成了996 个序列重叠群(contig)。第二步，我们选取长度大于600 bp 的contig 与＃56601 株全基因组序列做blastn 比对，以排定contig 彼此间的位置关系。在此基础上采用PCR 及测序的方法进行缺口填补工作，最终形成两个环状染色体： Chromosome I 和Chromosome II。第三步，通过纠正由重复序列导致的错误组装以及对低质量区域(weak region)的重新测序，使两条染色体序列的错误率降至0.05/10kb，符合国际认可的精确测序标准(错误率低于1/10kb)。 测序完成后，对问号钩体IPAV 株与＃56601 株全基因组进行了初步结构差异的比较。发现了IPAV 株较＃56601 株多出了长达14 kb 的DNA片段，此片段包含一个转座酶基因及其它一些功能基因。另外，在IPAV株上，还出现了一条约6.5 kb 的区域发生倒置的情况。其它一些结构的差异较小，大多在2 kb 以下。此外，我们还对＃56601 株中两个曾经遗漏的区域进行了校正。 本课题获得了问号钩体全基因组序列，为接下来的功能注释及分析致病株与非致病株钩体间的差异打下了基础。 第二部分 双曲钩端螺旋体溶血素基因tlyA 的克隆、表达及初步功能鉴定 为了研究非致病性双曲钩端螺旋体(Leptospira biflexa，简称双曲钩体)是否含有溶血素基因，并鉴定其溶血活性。我们对双曲钩体LEBIa2503 基因编码产物进行结构域预测、序列比对后，PCR 扩增目的片段、克隆到原核表达载体pET28b(+)，转化宿主细胞，并诱导表达产物进行初步功能鉴定。同时，以RT-PCR 检测LEBIa2503 的转录情况。 另外，也对双曲钩体菌体本身有无溶血活性进行检测。 我们发现双曲钩体LEBIa2503 基因与问号钩体tlyA 溶血素基因在蛋白水平上有相同的结构域，属于直系同源基因(orthologues gene)。原核表达的重组融合蛋白在羊血平板上出现β-溶血环。以RT-PCR 的方法能检测到在双曲钩体中有LEBIa2503 基因的转录，但双曲钩体菌体本身则检测不到溶血活性。 在本课题中，我们未发现双曲钩体有溶血活性，但其含有溶血素基因tlyA，并且在普通培养环境下能被转录，这对进一步研究其内在机制奠定了基础，并对探索致病性问号钩体致病机制提供了一定线索。