脂蛋白脂酶(IApoprotein Lipase，LPL)是脂质代谢的关键酶，由心肌、脂肪细胞、骨骼肌等肝外实质细胞合成分泌入血后，借助硫酸肝素葡糖胺聚糖(heparinsulfate proteoglycans，HSPG)结合于毛细血管内皮细胞表面，以非共价结合的单二倍体活性形式，并以载脂蛋白CⅡ为激活剂，水解血液中乳糜微粒(chylomicron，CM)和极低密度脂蛋白(very low density lipoprotein，VI,DL)中的甘油三酯(triglyceride，TG)。当LPL脂解功能缺陷时，会导致血浆CM大量蓄积、VLD/水平增高、LDL和高密度脂蛋白(HDL)水平降低。正常饮食条件下，患者可表现反复发作腹痛、肝脾大、急性胰腺炎、脂性视网膜炎、皮肤疹性黄瘤和空腹乳糜微粒血症，通常童年时期即发病。 人LPL基因位于第8号染色体短臂，长约30kb，含10个外显子和9个内含子，编码475个氨基酸，其中包括含27个氨基酸的信号肽。根据人胰脂酶结构，推测出了LPL分子三维结构。LPL分子有N-端和C-端2个结构域。N-端大约占全部序列的3/4，有以下几个功能域：①信号肽；②Ser<132>-His<241>-Asp<156>组成的催化活性中心；③决定特定脂酶底物的活性中心表面盖子；④apoCⅡ结合部位；⑤肝素结合部位；⑥4个二硫键和2个N-糖苷键结合部位等。C-端结构域介导LPL与脂蛋白结合，发挥“桥”的功能，同时对LPL同二聚体结构的维持具有重要意义。一旦编码各功能域的碱基序列发生突变，则会改变LPL的相应功能，表现为LPL的活性或含量降低；同时，当LPL基因调控区或内含子拼接点发生突变时，则会从转录水平影响LPL表达。 家族性脂蛋白脂酶缺乏症是一种极为罕见的常染色体隐性遗传性疾病。早期病例报告见于白人，黑人和日本人。我室于1996年报道了我国首例经酶学确诊的家族性脂蛋白脂酶缺乏症，之后又有台湾Kao JT(1999年)及香港Chan L(2000年)等有关LPL缺乏的病例报告。目前文献报道的LPL基因突变已达120多种，这些突变主要集中在外显子6和5，其次为外显子3，外显子1报告的突变最少，仅有1个。 我室前期工作发现一严重高甘油三酯血症和反复发作急性胰腺炎患者，与芬兰国家公共卫生研究院合作，对该例患者进行了临床研究。实验室检查发现，患者空腹血清呈乳糜状，为I型高脂蛋白血症表型。正常饮食条件下，TG浓度持续高于11.3mmol/L，PHP-IPL活性不及正常值的1/10，而载脂蛋白C—II(apolipoprotein C—II，apoC-II)浓度和肝脂酶(hepatic lipase，HL)活性正常，故可以排除由于apo C—II缺乏所引起LPL活性降低的可能。由此报道了我国首例经酶学确诊的家族性脂蛋白脂酶缺乏症。初步研究表明该患者LPL基因第6外显子有一杂合子突变(G916A/GIu<242>→Lys，LPL-242)。虽然此第242位氨基酸突变位于LPL催化活性中心附近，但大量有关LPL突变与临床表现的资料表明，单一的杂合子突变(heterozygous mutation)，仅使LPI活性或含量轻微或部分降低，只有纯合子(homozygote)或复合杂合子(compoundheteroZygote)突变患者，才出现严重的肝素后血浆LPL含量和活性降低或检测不到。依据该患者严重的临床表现，我们预测还存在另外的纯合子或杂合子突变。 本文对该患者LPL基因翻译起始密码子上游区域、外显子1～9(包括外显子内含子交界)再次进行PCR-SSCP分析，并直接测序。如预测一致，最终检测出另一发生在LPL基因第1外显子起始密码子(initimion codon)上的纯合子突变ATG→ATC(G177C/Met<1>→Ile，LPL-1)，并再次确认第6外显子Glu<242>→Lys杂合型突变。通过体外诱变，构建3个分别带有突变Met→Ile、Glu<242>→Lys和复合突变Met<,l>一Ile/Glu<242>→Lys的表达载体，瞬时转染COS-7细胞，分别从LPI mRNA转录、LPL蛋白表达量及LPL酶功能(脂解活性)三个方面，对突变进行体外表达研究，从而阐明了该例患者发病的分子机理。 1脂蛋白脂酶缺乏症患者脂蛋白脂酶基因的突变分析 对本例患者LPL基因进行突变分析。基因组DNA提取试剂盒分离患者和健康人外周血白细胞DNA，应用多聚酶链反应(PCR)对LPL基因的翻译起始密码子上游序列(自-743至+174共917bp)以及外显子1～9(包括外显子内含子交界区域)进行PCR扩增。采用浓度为8％的聚丙烯酰胺凝胶(polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE电泳，对扩增片段进行低离子强度．单链构象多态性(LIS-SSCP)分析。结果显示，患者第1和第6外显子片段电泳带型与健康人明显不同，怀疑突变阳性。DNA序列分析发现2个突变。1个是第177位碱基G突变为C，该纯合子变异导致翻译起始密码子ATG突变为ATC，即第1位的蛋氨酸突变为异亮氨酸(G177C/Met<1>→Ile)；依据Kozak定律，推测该突变导致的非AUG密码子仍可起始LPL蛋白翻译，但翻译效率大大降低，从而导致LPL的蛋白水平和相应的酶活性严重缺陷。另一个是第979位碱基G突变为A，为杂合性变异，导致LPL活性中心附近第242位带负电荷的谷氨酸突变为带正电荷的赖氨酸(G979A/Glu<242>→Lys)，该突变氨基酸可能与同样带正电荷的位于活性中心的His<241>相排斥，阻碍活性中心的形成，从而影响LPL的活性；然而患者在该位点上为杂合性突变，在导致LPL活性显著降低方面难以起主导作用。LPL基因该两位点突变均由我室首次报道。 2 脂蛋白脂酶缺乏症患者脂蛋白脂酶基因突变表达载体的构建 通过体外诱变，分别构建3个表达载体。第1个载体带有LPL基因起始密码子突变(G177C/Met<1>→Ile，LPL-1)：设计2条带相应酶切位点的引物，上游引物带有该突变，下游引物包含终止子，以LPL全长cDNA克隆为模板，PCR扩增获得带有LPL-1突变的目的片段。第2个载体带有第6外显子突变(G979A/Glu<242>→Lys，LPL-242)：设计3条引物，突变引物和两侧的上、下游引物。先以突变引物和下游引物一起扩增带有突变位点的片段，再以此PCRW物片段为引物与上游引物一起扩增获得目的片段。第3个载体带复合突变(Met<1>→Ile/Glu<242>→Lys，LPL-1-242)，上游引物和中间引物分别含有LPL-1和LPL-242突变，PCR扩增方法同LPL-242突变载体。扩增的LPLcDNA目的片段直接克隆入pMDl8-T载体，经双酶切后亚克隆入经同样酶切的pcDNA3载体，并测序确定各突变碱基诱变成功。 3 脂蛋白脂酶基因突变的体外表达研究 脂质体法瞬时转染COS-7细胞，常规条件下孵育24h，加入肝素后继续培养12h，收集细胞及培养液。荧光定量实时PCR分析细胞内LPL cDNA的mRNA表达水平，western blot及酶联免疫吸附分析法(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA)分析测定细胞培养上清及细胞裂解液中LPL的表达水平及含量。放射性同位素标记法检测LPL活性。结果表明：各突变型LPL mRNA片段大小和表达量与野生型相比无显著差异(P>0.05)；突变LPL-1导致LPL的含量(ELISA)大约为野生型的3％，活性约为2％；而LPL-242酶蛋白含量正常，但检测不到活性；复合突变LPL-1-242导致的蛋白表达降低与LPL-1相同，而酶活性检测不到与LPL-242相同。以上数据证实了哺乳动物细胞中，LPL翻译起始密码子突变仍可起始LPL蛋白翻译，但翻译效率大大 降低。对位于酶活性中心附近L2L-242突变导致LPL酶活性完全丧失的最好解释是，此突变导致的带正电荷的Lys<242>残基，与同为带正电荷的His<242>残基相排斥，影响了LPL催化三联体Asp<156>-Ser<132>-His<242>立体构型的形成，但不影响酶含量。LPL基因Met<1>→Ⅱe/Glu<242>Lys复合突变，为一严重突变，可导致LPL酶含量极显著降低，活性完全丧失。 结论 (1) 患者脂蛋白脂酶基因经进一步突变筛查和DNA序列分析，发现LPL基因第1外显子起始密码子(initiation codon)上新的纯合突变类型Met<1>→Ⅱe，并再次确认第6外显子Glu<242>→Lys杂合型突变。 (2) 成功构建3个分别带突变LPL-1、LPL-242和复合突变LPL-1-242的表达载体，荧光定量实时PCR分析显示，各突变型LPL mRNA片段大小和表达量与野生型相比无显著差异，表明各突变不影响LPL基因的转录。 (3) 蛋白表达量及酶活性分析测定表明，突变LPL-1导致LPL的含量(ELISA)大约为野生型的3％，活性约为2％：证实LPL-1纯合突变导致的非AUG密码子可起始LPL蛋白翻译，但翻译效率大大降低，从而导致LPL的蛋白水平和相应的酶活性严重缺陷。 (4) LPL-242酶蛋白含量正常，但检测不到活性。提示LPL-242突变引起LPL活性中心附近第242位带负电荷的谷氨酸突变为带正电荷的赖氨酸(G979A/G1u<242>→Lys)，该突变氨基酸可能与同样带正电荷的位于活性中心的His<242>相排斥，阻碍活性中心的形成，从而丧失酶活性，但不影响其蛋白表达水平。 (5) 复合突变LPL-1-242为一严重突变，可导致LPL酶含量极显著降低与LPL-1相同，活性完全丧失与LPL-242相同。 (6) 实验数据表明，LPL-1纯合突变，而不是LPL-242杂合性变异在导致该患者严重高甘油三脂血症和反复发作急性胰腺炎过程中起主要作用。本文LPL基因的Met<1>→Ⅱe突变和Met<1>→Ⅱe/Glu<242>→Lys复合突变的体外表达研究系首次报道。