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背景及目的:阴茎硬结症(Peyronie’s Disease,PD)是一种常见的,严重影响着男性健康的疾病,但其病因不明,且暂缺乏较理想的治疗方法。损伤修复和纤维化是组织损伤后两种不同的结局,若损伤后组织中成纤维细胞持续激活,无法通过凋亡途径清除,则发生组织纤维化。脂质干细胞(ADSCs)是一种易获取,纯度高的干细胞。之前研究表明ADSCs能促进基质金属蛋白酶(MMPs)分泌,降解胶原纤维,促进激活的成纤维细胞凋亡,推测ADSCs可能对PD有较好的治疗效果。本研究拟通过多次白膜微小损伤构建新的PD动物模型,探讨多次损伤导致PD的发病机制;分析纤维化过程中关键细胞(肌成纤维细胞MFs)的激活和调控过程;利用ADSCs通过分泌MMPs和多向分化改变局部微环境逆转纤维化进程,观察ADSCs对肌成纤维细胞和细胞外基质的影响;评估ADSCs对PD的预防和治疗效果,为ADSCs治疗PD提供理论和和实验依据。方法:1.通过比较单次和多次大鼠阴茎白膜局部注射葡萄糖酸氯己定乙醇溶液(ChE)后,评估大鼠阴茎白膜海绵体组织结构和功能变化。具体分组:对照组局部注射生理盐水1-5次(对照组1)、单次局部注射ChE、2次局部注射ChE、3次局部注射ChE、4次局部注射ChE、5次局部注射ChE、单次局部注射TGF-β 1(对照组2)。利用H&E染色和masson染色法评估大鼠阴茎白膜炎症纤维化程度;大鼠阴茎人工勃起后测定弯曲角度;Weigert氏染色评估大鼠阴茎弹性纤维的变化;电刺激勃起神经测定大鼠勃起功能;免疫组化法测定纤维化关键细胞因子TGF-β 1的表达;免疫荧光检测大鼠阴茎白膜和海绵体α SMA(MFs激活标志物)表达及分布。2.将TGF-β 1作用于原代大鼠阴茎白膜成纤维细胞(TAFs)后,Western blot法和细胞免疫荧光法检测TAFs被激活为MFs的过程中α SMA的表达变化;通过测定细胞上清羟脯氨酸含量变化,评估胶原分泌能力;凝胶收缩试验评估MFs的收缩能力;在TGF-β 1作用后加入雌激素(E2)利用上述方法评估激活的MFs调控过程。最后利用Western blot法测定主导胶原分泌Smad信号通路和主导细胞收缩Rho/ROCK通路相关蛋白水平的变化。3.提取大鼠原代ADSCs与不同浓度MFs(经TGF-β 1激活的TAFs)混合培养,Western blot法测定α SMA的表达变化,试剂盒测定细胞上清羟脯氨酸含量。通过 ADSCs 与 MFs Transwell 共培养,Western blot、real time PCR 和羟脯氨酸测定评估ADSCs作用前后,MFs胶原蛋白合成分泌能力及Smad通路相关蛋白表达情况。凝胶收缩实验和Western blot法评估MFs自身收缩能力及Rho/ROCK通路相关蛋白的表达。Western blot、real time PCR和ELISA法测定基质金属蛋白酶MMPs(MMP9,MMP13,MMP2,MMP3)合成和分泌量的变化。MTT法和Western blot法比较ADSCs作用前后,MFs增殖凋亡情况和caspase-3、caspase-9 蛋白含量。4.将SD大鼠分为5组,造模组:5次注射葡萄糖酸氯己定乙醇溶液;预防组1:造模同时注射ADSCs悬液;预防组2:造模同时注射CM-ADSCs;治疗组1:造模结束后用ADSCs悬液干预;治疗组2:造模结束后用CM-ADSCs干预。利用人工勃起实验、masson染色、电刺激勃起神经后海绵体压力测定、Weigert氏染色,免疫组化、免疫荧光、Western blot法,评估ADSCs和CM-ADSCs对PD大鼠治疗和预防作用及相关信号通路蛋白变化。结果:1.与单次损伤组相比,我们发现多次损伤后大鼠阴茎弯曲角度明显增加,发生阴茎弯曲大鼠比例增加,阴茎白膜和海绵体形成明显的纤维化斑块,弹性纤维断裂且结构紊乱,勃起功能轻度下降,大鼠阴茎组织中TGF-β 1和α SMA表达量明显增加(P<0.05)。2.TGF-β1作用于TAFs后α SMA表达增加,使其向MFs转化;通过诱导Smad2磷酸化,激活胶原合成分泌过程使细胞上清羟脯氨酸含量增多;通过上调RhoA和ROCK2表达使细胞具有明显的收缩性(P<0.05)。值得注意的是,上述过程可被E2抑制(P<0.05)。3.ADSCs与MFs共培养,MFs的α SMA表达减少,细胞上清羟脯氨酸含量减少,胶原合成能力下降,RhoA和ROCK2表达减少导致细胞收缩性减弱。ADSCs分泌大量的细胞因子和MMPs使细胞外基质降解,抑制MFs增殖,促进MFs凋亡(P<0.05)。ADSCs与MFs混合培养,当ADSCs数量较MFs明显多时,αSMA表达降低,羟脯氨酸含量减少;当ADSCs数量较MFs明显少时,α SMA表达升高,羟脯氨酸含量增加(P<0.05)。4.ADSCs和CM-ADSCs对大鼠PD均有治疗和预防作用,减小阴茎弯曲角度,抑制局部胶原纤维沉积,修复受损的弹性纤维,通过增加iNOS和vWF的表达增强勃起功能,减少阴茎白膜α SMA的表达,抑制局部MFs的激活和胶原分泌(P<0.05)。值得注意的是,ADSCs效果较CM-ADSCs好,预防效果较治疗效果好(P<0.05)。实验结论大鼠阴茎白膜及海绵体在单次损伤后可完全修复,而随着损伤次数增多则局部形成纤维化,多次阴茎白膜注射ChE可构建理想的大鼠PD模型。体外实验表明TGF-β 1激活TAFs,使其转化为MFs,并通过Smad依赖通路促进胶原合成和分泌,和Smad非依赖通路(RhoA/ROCK2)促进细胞收缩。ADSCs可抑制MFs的激活,抑制胶原纤维合成和分泌,降解已形成的胶原,抑制细胞收缩,促进MFs的凋亡。ADSCs和CM-ADSCs对PD大鼠有较好的预防和治疗作用,前者效果更好,且预防效果比治疗效果好。