研究背景及目的肝细胞癌是全球第五大常见恶性肿瘤,肝癌防治始终是关系民生的重大健康问题。而肝脏结构复杂,肝实质细胞的稳定状态离不开与非实质细胞的密切交互作用,共同维持肝脏发挥正常生理功能。其中,巨噬细胞是非实质细胞中占比最高的类群之一,在肝脏稳态中发挥关键作用。巨噬细胞作为免疫防御的第一道防线,可塑性较强,具有高度的异质性,对不断变化的微环境表现出不同的活化表型,因而在肿瘤发生发展中发挥了多重作用。一方面,巨噬细胞的炎症应答、吞噬作用以及抗原提呈功能使其具有抗肿瘤作用;另一方面,巨噬细胞过度激活可以破坏炎症微环境稳态,引发慢性炎症状态。在肿瘤微环境免疫抑制机制的研究中,可塑性极强的巨噬细胞发生了表型和功能的改变,转化为肿瘤相关巨噬细胞（TAM）,促进肿瘤的恶性进展。但是,肿瘤微环境中调控巨噬细胞表型转化的关键事件及分子网络仍不清楚。因此,深入探究巨噬细胞在肿瘤进展中的功能机制及驱动因素,研发选择性调控巨噬细胞免疫重塑的药物,可能成为肿瘤靶向治疗的新策略。在肝癌多样性、复杂性的病因背后,慢性炎癌转化是绝大多数肝癌发生的共同病理过程。炎症是肿瘤的十大基本特征之一,非可控性炎症影响肿瘤的演化进程,可谓是肿瘤发生发展的始动因素和驱动引擎。炎症微环境稳态的维持离不开诸多免疫细胞的协同作用,固有免疫系统如巨噬细胞、NK细胞等率先对刺激信号作出反应,这些细胞之间及与周围基质细胞间相互作用,通过促炎和抑炎两种对立的力量相互制衡,影响着炎症进程。巨噬细胞是机体调控炎症稳态的关键细胞类型,由于高度异质性和可塑性,其对炎症的调节既发挥正向的促炎功能,同时又是抑制过度炎症激活的“主力军”,当自身调节机制受损,在外来致病因素作用下,炎症稳态被打破,非可控性炎症可驱动机体恶性转化形成肿瘤。然而,我们对肝脏炎症恶性转化的病理机制及节点分子仍缺乏深入理解,巨噬细胞在其中的具体功能和调节机制尚需进一步明确。癌蛋白Gankyrin（又称PSMD10,p28）是调控非可控性炎症恶性转化的关键节点分子,最初即是在原发性肝癌组织中被克隆,其在肝癌形成中发挥重要驱动作用。Gankyrin是含有七个锚蛋白重复序列（ankyrinrepeat,ANK）,分子量为27KD的蛋白,可与26S蛋白酶体调节亚基19S亚基结合,促进p53泛素化降解和Rb的磷酸化,抑制细胞凋亡和促进细胞周期进程,进而加速肿瘤的恶性进展。本实验室2000年于国人肝癌样本中克隆到了该基因,经多年来研究发现,肝细胞中Gankyrin发挥促癌功能,可感知微环境中上游IL1β信号,激活下游AKT、JNK、VEGF等多种信号通路,引起肿瘤血管新生、上皮间质转化、侵袭迁移;还能通过调控OCT4增强肝癌干细胞干性和功能,促进肝癌细胞耐药等,进而加速肝癌的发生发展。随后,国内外陆续研究显示,Gankyrin还高表达于其他的上皮来源的肿瘤组织中,与多种肿瘤的生长和进展相关。但是,以上研究均是基于细胞学的结果。Gankyrin在体内的作用尚不十分明确,尤其是在非实质细胞中的作用并不清楚。本实验室与南京大学合作构建了Gankyrin条件性敲除小鼠,以此为基础,相继培育出全身性敲除和肝细胞特异性敲除Gankyrin小鼠,通过化学诱导的肝癌模型,对比分析发现二者在肝癌发生发展中的作用迥异,提示肝癌发生过程中Gankyrin在肝实质细胞和全身中的作用不同。随即构建了髓系细胞Gankyrin敲除小鼠,结合细胞学实验,研究了Gankyrin对巨噬细胞功能调节,深入探讨了Gankyrin在调控机体炎症及肝脏炎癌转化中的作用和机理,以期为肝癌的精准化防治提供新的治疗策略和分子靶标。研究方法1、分别构建Gankyrin在肝细胞、全身以及髓系细胞敲除小鼠模型,综合运用单纯DEN诱导、DEN联合CCl4诱导及癌基因联合诱导的多种小鼠肝癌模型,研究Gankyrin在体内不同类型细胞敲除后对肝癌形成的影响。2、分离荷瘤小鼠肝脏免疫细胞,流式细胞术分析髓系细胞Gankyrin敲除对肝脏肿瘤微环境中免疫细胞类群的影响。3、髓系细胞Gankyrin敲除小鼠,体内注射中和性抗体或脂质体,分别清除中性粒细胞、巨噬细胞及CD8+T细胞,通过皮下荷瘤肝癌细胞,明确Gankyrin影响肝癌发生发展与不同免疫细胞类群间的联系。4、原代分离小鼠骨髓来源的巨噬细胞BMDM,经体外诱导为肿瘤相关巨噬细胞TAM后,与肝癌细胞共同行小鼠皮下荷瘤,研究TAM中Gankyrin对肿瘤生长的作用。5、在小鼠肝癌模型中流式检测巨噬细胞上PD-1/PD-L1的表达变化,并在BMDMGank-/-中回补Gankyrin,明确Gankyrin对巨噬细胞PD-1表达的调控作用。6、利用LPS联合D-GalN诱导的急性肝损伤模型以及老龄化小鼠的自发慢性炎症状态,研究小鼠巨噬细胞Gankyrin缺失对体内炎症水平的影响。7、在小鼠BMDM以及在人单核细胞系THP1中构建Gankyrin差异表达细胞系,通过炎性物刺激及与肿瘤细胞共培养等方法,体外探究Gankyrin水平变化对巨噬细胞炎症应答的影响。8、转录组测序分析BMDMGankyrin敲除后巨噬细胞炎症因子和相关通路基因转录水平的变化,GSEA分析NF-kB通路激活情况。9、免疫共沉淀研究BMDM中Gankyrin与p65的结合,激光共聚焦IF观察Gankyrin对p65细胞亚定位的影响,结合慢病毒介导回补Gankyrin及其截短体验证,明确Gankyrin对NF-kB通路的调节作用。10、体内外应用p65入核阻断剂Tomatidine,进一步明确Gankyrin缺失影响巨噬细胞炎症应答的机制。11、Tomatidine抑制NF-kB通路激活,研究巨噬细胞Gankyrin调控PD-1表达与NF-kB通路的关系。12、分析比较健康人群以及肝癌患者外周血PBMC中Gankyrin的变化,及其与IL1b的相关性。13、分离临床肝癌样本中的TAM,在NSG小鼠中与人肝癌细胞HepG2共同荷瘤,分析TAM中内源性Gankyrin表达水平与肿瘤生长的相关性;慢病毒介导敲降TAM中Gankyrin表达水平后,与HepG2共同荷瘤NSG小鼠,进一步明确TAM中Gankyrin水平对肿瘤生长的影响。研究结果1、在肝癌发生过程中,Gankyrin在肝实质细胞和全身中发挥不同的作用:肝细胞中Gankyrin缺失,肝癌形成减少;全身Gankyrin缺失却加速肝癌形成。2、髓系细胞Gankyrin缺失可引起肿瘤微环境中免疫细胞构成比例改变,中性粒细胞与巨噬细胞显著增多,而CD8+T细胞比例下降。3、髓系细胞Gankyrin缺失小鼠体内分别清除中性粒细胞、巨噬细胞及CD8+T细胞,结果发现主要是巨噬细胞Gankyrin发挥抑癌作用。Gankyrin缺失的BMDM和肝癌细胞共同行小鼠皮下荷瘤,可以显著促进肿瘤生长。Gankyrin可抑制BMDM的吞噬功能。4、Gankyrin缺失可促进巨噬细胞PD-1表达上升。5、Gankyrin髓系敲除的小鼠体内炎症水平增强,且体外Gankyrin缺失或敲低的巨噬细胞的炎症应答水平明显升高,提示巨噬细胞Gankyrin可以抑制炎症过度激活。6、转录组分析显示Gankyrin缺失的巨噬细胞NF-kB通路显著激活,提示巨噬细胞Gankyrin抑制NF-kB通路活化。7、巨噬细胞Gankyrin可结合p65阻止p65入核,从而抑制NF-kB通路激活。p65出入核阻断剂Tomatidine可抑制巨噬细胞Gankyrin缺失引起的炎症过度激活,并抑制巨噬细胞Gankyrin缺失诱导的肝癌形成。8、抑制NF-kB通路活化可降低Gankyrin缺失的巨噬细胞PD-1水平,提示巨噬细胞Gankyrin—NF-kB—PD-1轴的失调控与肝癌发生发展密切相关。9、临床水平上,肝癌患者外周血PBMC中Gankyrin转录水平显著低于健康人群。肝癌组织分离的肿瘤相关巨噬细胞中Gankyrin水平与肿瘤生长呈负相关关系。敲降TAM中Gankyrin水平可显著促进肿瘤生长。研究结论肝实质细胞和髓系细胞中Gankyrin在肝癌发生发展中发挥不同的作用。巨噬细胞Gankyrin主要发挥抑炎抑癌功能:巨噬细胞Gankyrin负调控巨噬细胞炎症应答,从而抑制肝脏炎癌恶性转化。机制上,巨噬细胞Gankyrin可与NF-kB/p65亚基结合阻止其入核,抑制了其下游炎症因子及PD-1的表达,进而抑制肿瘤进展。本研究发现了癌基因Gankyrin在巨噬细胞中发挥了抑癌功能,阐述了Gankyrin在巨噬细胞中抑制炎症应答的机制,发现了巨噬细胞内Gankyrin—NF-kB—PD-1信号轴的失调控对肝癌发生的影响,为肝癌防治提供了新的思路和治疗靶标。