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氮素是自然界中1植物生长的最主要的限制因子之一。豆科植物与根瘤菌之间的根瘤共生(RNS, root nodule symbiosis)固氮系统是自然界中氮素最直接和经济的来源,在农业生产中具有十分重要的意义。然而,共生固氮具有宿主专一性,仅限于豆科植物和极个别非豆科植物,目前想通过遗传工程的方法实现重要谷类作物的共生固氮仍面临巨大的挑战,有待于共生固氮分子机理的进一步揭示。根瘤的形成过程可分为根瘤菌侵染和根瘤器官发生两个复杂的过程。近十年来,以模式豆科植物苜蓿(Medicago truncatula)和百脉根(Lotus japonicus)为材料,在宿主植物中鉴定出一系列与共生相关的基因,初步建立了共生信号转导模式图。其中依赖钙和钙调素的蛋白激酶(CCaMK)和两个GRAS类转录因子(NSP1和NSP2)同时控制根瘤菌侵染和根瘤器官发生两个过程,并预测CCaMK、NSP1和NSP2形成复合体行使功能,但缺乏明确的生物化学和分子生物学证据。本论文以百脉根为材料,围绕CCaMK、NSP1和NSP2三个基因开展了以下三个方而的工作：1.分别以CCaMK, CCaMK自磷酸化位点突变形式CCaMK (T265I)和蛋白激酶结构域CCaMK (1-300aa)为诱饵,筛选百脉根AD-cDNA酵母双杂交文库。其中以蛋白激酶结构域为诱饵鉴定到一个新蛋白,命名为CIP73 (CCaMK interacting protein of approximately 73 kDa)。CIP73开放阅读框包含2,076个核苷酸,编码的蛋白质由691个氨基酸残基组成,分子量约为73kD。蛋白质序列分析显示CIP73的N端含有一个和泛素(ubiquitin)同源的类似Scythe_N结构域的区域。只有当CCaMK的C端钙调素结合结构域和EF hand结构域去除后CCaMK才能与CIP73在酵母细胞中相互作用。进一步的缺失突变分析显示CCaMK的N端80个氨基酸(residues80-160)是与CIP73相互作用所必需的。虽然全长的CCaMK与CIP73在酵母细胞中没有检测到相互作用,但体外蛋白Pull-down和体内双分子荧光互补(BiFC)实验证明全长CCaMK与CIP73之间存在相互作用。通过半定量RT-PCR,检查了CIP73和CCaMK在百脉根不同器官中的表达情况。相对于茎和叶,CIP73和CCaMK在根中都大量表达,不同的是CIP73在根瘤中仅检测到微弱的表达,而CCaMK在根瘤中大量表达。接种了根瘤菌后CIP73的表达和CCaMK相似,有一个有明显的表达量下降的过程。CIP73的C端CIP73(486-691)与GFP的融合蛋白在洋葱表皮细胞和百脉根毛根细胞的细胞核中能检测到很强的荧光。更重要的是,在钙离子和钙调素存在的条件下,CCaMK在体外能够磷酸化CIP73的N端(1-413aa)区域。RNA干扰(RNAi)降低CIP73的表达能抑制结瘤,但对菌根共生没有明显的影响,表明CIP73在结瘤过程中行使重要功能。2.百脉根CCaMK的自磷酸化位点突变后,在没有根瘤菌的情况下能形成自发根瘤。另一方面,水稻的CCaMK能够互补百脉根CCaMK失去功能的突变表型,并且水稻CCaMK突变影响菌根共生。为了研究CCaMK在水稻中的共生效应,分别构建了水稻和百脉根CCaMK的自磷酸化位点突变Os T263A和Lj T265I的超表达(双CaMV35S)和自身启动子表达载体,并转入水稻中,收获了T1代转基因种子。PCR扩增目标基因和GUS染色鉴定每个片段均有20多个阳性转基因系,但其共生效应还有待于进一步实验验证。3.以NSP2的GRAS结构域为诱饵,在百脉根AD-cDNA酵母双杂交文库中鉴定到一个与NSP2相互作用的新蛋白,命名为IPN2 (Interacting Protein of NSP2)。IPN2开放阅读框包含1,074个核苷酸,编码的蛋白质由358个氨基酸残基组成,分子量约为40 kD。蛋白质序列分析显示IPN2的N端含有一个单个重复的MYB类结合DNA结构域和一个预测的coiled-coil结构域。在酵母中,NSP2的GRAS结构域是和IPN2相互作用所必需的,而IPN2的coiled-coil结构域是和NSP2相互作用所必需的。另外通过体外蛋白Pull-down和体内双分子荧光互补(BiFC)实验进一步证实了NSP2与IPN2之间的相互作用。而且,NSP2与IPN2共定位于百脉根毛根细胞的细胞核中。IPN2在酵母细胞中有很强的转录激活作用,并且能结合NIN的启动子。IPN2的mRNA在百脉根不同器官中广泛表达,并且其启动子在转基因毛根的韧皮部特异表达。IPN2的超表达能促进结瘤,而RNAi降低IPN2的表达则抑制结瘤,表明IPN2在结瘤过程中行使重要功能。