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牛病毒性腹泻病毒（Bovine viral diarrhea virus,BVDV）是黄病毒科、瘟病毒属成员,病毒粒子呈球形,有囊膜,核酸为长约12～13kb的单股正链RNA,根据能否使培养细胞产生细胞病变将其分为两种生物型:产细胞病变型和非细胞病变型。BVDV主要侵害牛、鹿和猪等动物,引起以肠道疾病、繁殖障碍、呼吸系统疾病、胎儿畸形和持续性感染。 BVDV的基因组包含5’-非编码区（5’-NTR）、编码一个大的聚合蛋白的开放阅读框架和3’-非编码区（3’-NTR）。研究表明5’-NTR能形成稳定的二级结构,具有核糖体进入位点,是BVDV的翻译和复制的调控元件。由于BVDV 5’-NTR的序列高度保守,所以常根据这一区域设计引物,进行BVDV的检测。 目前BVDV的检测方法有病原分离、中和试验、直接荧光抗体试验、ELISA及核酸杂交技术、RT-PCR等多种方法,但血清学方法多存在费时、费力、准确率低等缺点,而分子生物学的常规方法虽然在某些方面可以弥补,但假阳性、环境污染、重复性不高等不足限制了推广应用, 随着分子生物学的发展,实时定量荧光RT-PCR技术日益成熟,尤其是外标实时定量荧光PCR被认为是迄今为止最准确、重复性最好的定量方法,广泛应用于基因表达、病原体检测等诸多领域。因此为适应进出口检疫的要求建立一种快速、灵敏、特异、重复性良好的检测方法势在必行。 试验中应用MDBK细胞培养牛病毒性腹泻病毒标准株Oregon C24V,72小时出现细胞病变（CPE）:细胞变圆、细胞核固缩到边缘、胞浆内出现大量空泡、脱落。在长有单层细胞的96孔细胞培养板上依次加入10倍稀释的Oregon C24V 0.1mL,记录病变孔数及其出现的稀释倍数,根据Reed-Muench法计算培养的Oregon C24V TCID50=10-4.3。 以NADL、New York-1、Singer（Ia）、Oregon C24V（Ib）、Draper（Ib）等参考BVDV毒株5’端非编码区为参考序列,设计合成了实时定量荧光RT-PCR引物和TaqMan荧光探针,设计目的片段大小94bp,TaqMan荧光探针5’端报告荧光为TAM,3’端淬灭荧光为TAMAR。初步设计反应参数后体系参数优化结果为:25mM Mg2+ 5μL、5U/μL Taq酶0.5μL、20μM引物混合物1μL与20μM探针1.5μL,退火延伸温度为60℃。进一步进行灵敏性、重复性、特异性试验,结果本方法最低可检测到0.1TCID50;特异性试验中,BVDV阴、阳性对照成立,检测猪瘟病毒、牛轮状病毒、牛传染性鼻气管炎病毒