第一章c-Maf泛素结合酶E2的发现目的:转录因子c-Maf可以发生多聚泛素化,但其具体的泛素化酶尚不清楚。本部分将寻找参与c-Maf泛素化修饰的泛素结合酶E2。方法:(1)利用免疫共沉淀方法,富集与c-Maf相互作用的蛋白质。(2)通过SDS-PAGE凝胶电泳分离共沉淀的蛋白样品,利用高灵敏度的考马斯亮蓝染色法对凝胶进行染色。(3)利用LC-MS/MS技术分析蛋白样品,最后通过质谱数据库分析发现E2。(4)发现的E2利用免疫共沉淀、免疫印迹等方法进行验证。结果:(1)免疫共沉淀结合LC-MS/MS技术发现了参与c-Maf泛素-蛋白酶体降解过程的5个重要组分,包括泛素激活酶Uba1,泛素结合酶UBE2O以及三种泛素连接酶HUWE1、UBR5、HERC4。(2)UBE2O的质谱结果与数据库比对显示,共沉淀的蛋白样品中存在5条UBE2O的特异性肽段。(3)免疫共沉淀结合免疫印迹实验发现UBE2O与c-Maf存在相互作用,并介导c-Maf的泛素化。结论:c-Maf存在泛素-蛋白酶体降解通路,并且UBE2O可能是c-Maf潜在的泛素结合酶。第二章UBE2O介导c-Maf蛋白泛素化的功能研究目的:探索UBE2O在c-Maf泛素-蛋白酶体降解过程中的作用及其机制。方法:(1)利用蛋白免疫印迹技术和放线菌酮测蛋白质半衰期实验研究UBE2O对Maf蛋白表达稳定性的影响。(2)利用荧光素酶活性检测技术分析UBE2O对c-Maf转录活性的影响。(3)利用慢病毒介导技术探索UBE2O对内源性c-Maf表达以及对多发性骨髓瘤细胞凋亡的影响。结果:(1)UBE2O减弱了c-Maf和Maf B蛋白表达的稳定性,但对Maf A的表达没有显著影响。(2)UBE2O影响了c-Maf对下游靶基因CCND2启动子的转录活性。(3)过表达UBE2O促进了内源性c-Maf的降解,并诱导多发性骨髓瘤细胞的凋亡结论:UBE2O是c-Maf潜在的特异性泛素结合酶。