白念珠菌易于感染、难以防治的主要原因在于其致病机制复杂且耐药现象严重。近年来,国内外研究者陆续发现一些新的基因可能与白念珠菌的致病过程或耐药机制相关,因此,深入研究这些基因的具体功能对进一步了解白念珠菌的致病机理并缓解其耐药现状具有重要意义。目的近年来已有零星报道推测乙醇脱氢酶I(Alcohol dehydrogenase I,adh1p)的编码基因ADH1可能与白念珠菌的致病力和耐药性相关,本课题组前期研究也发现,ADH1基因的表达产物Adh1p可能参与白念珠菌对唑类药物耐药,但这些推论迄今尚无直接证据支持。因此,本课题通过直接敲除白念珠菌ADH1的双等位基因,旨在直接证实ADH1基因是否确实影响菌株自身的致病力及其对药物的敏感性,并初步探讨其对线粒体有氧呼吸的影响,为今后临床上白念珠菌感染的防治及新型抗真菌药物的开发提供了重要的理论依据。方法第一部分:首先采用SAT1-Flipper基因敲除策略构建白念珠菌ADH1基因缺失菌和回复菌,该方法以标准菌SC5314为亲本菌,诺尔斯菌素(nourseothricin,NAT)为筛选标记,pSFS2为载体构建敲除质粒,通过两轮同源重组分别替代目的基因的两条等位基因,并以套式PCR的方法进行鉴定。随后进行菌株生长动力学实验,将亲本菌、基因缺失菌和回复菌分别等浓度培养,在不同的时间点测量各菌株的OD600值,从而绘制各菌株的生长曲线并计算倍增时间。第二部分:分别通过酵母菌微量液基稀释法CLSI M27-A3、M27-S4和琼脂点板实验(Spot assay),观察并测定各菌株对氟康唑(fluconazole,FLC)、伊曲康唑(itraconazole,ITR)、伏立康唑(voriconazole,VRC)、酮康唑(ketoconazole,KCZ)、两性霉素B(amphotericin B,AmB)和卡泊芬净(Caspofungin)等抗真菌药物的最低抑菌浓度(MIC80)和菌落生长情况,以判断ADH1基因的缺失对不同机制抗真菌药物体外敏感性的影响。第三部分:除药物敏感性实验外,本课题同时通过一系列实验从不同层面考察ADH1基因缺失对白念珠菌致病力的影响。(1)菌丝形成实验:分别将各菌株置于四种常用的固体和液体菌丝诱导培养基(Spider、Lee’s、YPD+10%FBS和SLAD)中培养,以考察ADH1基因对菌丝形成能力的影响;(2)生物膜形成实验:采用XTT还原法测定各菌株在RPMI-1640液体培养基中的生物膜形成情况,以考察ADH1基因对生物膜形成能力的影响;(3)体外粘附实验和细胞表面疏水性实验:分别将各菌株置于Spider和YPD液体培养基中培养,以考察ADH1基因对白念珠菌细胞的粘附能力和相对疏水性的影响;(4)实时荧光定量PCR(Real-Time RT PCR)实验:考察并分析目的基因敲除前后菌丝和粘附特异性相关基因ALS1、ALS3、HWP1和CSH1 mRNA水平的表达情况;(5)体内感染实验:分别以小鼠,秀丽隐杆线虫和蜡螟模型作为体内感染模型,考察ADH1基因在不同的体内环境中对菌株致病力的影响。第四部分:分别通过不同的荧光染料试剂盒检测ADH1基因缺失后白念珠菌细胞内线粒体膜电位水平、ATP含量和内源性活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)水平的变化,初步考察ADH1基因对线粒体有氧呼吸的影响。结果第一部分:采用SAT1-Flipper基因敲除策略首先成功构建了白念珠菌ADH1基因缺失菌ADH1M2B(adh1Δ/Δ)和回复菌ADH1ReB(adh1Δ/ADH1)。生长动力学实验结果示,与SC5314和ADH1ReB相比,ADH1M2B在对数生长期的的倍增时间差异不大,且SC5314和ADH1ReB的生长无明显差异,说明ADH1基因敲除后并没有显著限制菌株的生长。第二部分:微量液基稀释法和Spot assay实验结果发现,与SC5314和ADH1ReB比较,ADH1M2B对多种唑类抗真菌药物FLC、ITR、KCZ和VRC,多烯类抗真菌药物AmB和丙烯胺类抗真菌药物卡泊芬净的MIC80表现为无变化或仅降低一个浓度梯度,差异无统计学意义,且菌落生长状态基本无差异,说明ADH1基因缺失后,菌株对上述多种抗真菌药物的敏感性基本无影响。第三部分:菌丝形成实验结果发现,与SC5314比较,ADH1M2B在四种液体或固体菌丝诱导培养基中的菌丝形成能力均显著减弱,在液体培养基中只能形成芽孢或很短的假菌丝且在固体培养基中形成的菌落边缘光滑无放射性菌丝,而当ADH1基因回复时,菌丝的形成能力也得以回复,说明ADH1基因可能是影响白念珠菌菌丝形成的关键基因;生物膜形成实验结果显示,与SC5314比较,ADH1M2B在RPMI-1640液体培养基中生物膜形成能力显著下降,差异有统计学意义(P<0.05),而ADH1ReB与SC5314的生物膜形成能力相似,差异无统计学意义,由此说明,ADH1基因对白念珠菌生物膜形成起重要作用;体外粘附实验和细胞表面疏水性实验结果示,与SC5314和ADH1ReB比较,ADH1M2B在体外的粘附能力和细胞表面相对疏水性菌显著减弱,说明ADH1基因可显著影响白念珠菌细胞的粘附能力和细胞表面相对疏水性;Real-Time RT PCR实验结果示,与SC5314和ADH1ReB比较,ADH1基因敲除后菌株内重要致病力相关基因ALS1,ALS3,HWP1和CSH1的mRNA表达水平均显著下调,进一步证实ADH1基因与菌丝形成和粘附相关;体内感染实验结果证实,与SC5314和ADH1ReB比较,ADH1基因缺失后,小鼠、秀丽隐杆线虫和蜡螟的生存时间均明显延长,且小鼠的脏器组织负荷菌量显著减少,肾脏病理损伤明显减弱,说明ADH1基因可显著降低白念珠菌体内模型的致病力。第四部分:线粒体能量代谢相关实验结果初步证实,作为白念珠菌无氧酵解关键酶乙醇脱氢酶Ⅰ的编码基因,ADH1缺失对细胞内线粒体有氧氧化有显著影响,具体表现为线粒体膜电位水平和ATP含量均显著降低,内源性活性氧(ROS)水平显著升高。结论本课题通过直接敲除白念珠菌ADH1的双等位基因,并进行一系列表型研究,发现该基因缺失后对多种常见抗真菌药物的敏感性无明显影响,但可显著减弱白念珠菌在体内和体外的致病力,并证实致病力变化与菌株生长动力无关,同时,本实验初步发现作为无氧酵解关键酶的编码基因,ADH1缺失对菌株线粒体有氧呼吸有明显影响,为下一步深入研究其对致病力影响的作用机制是否与线粒体有氧呼吸相关提供新的思路和线索。