研究背景多形性胶质母细胞瘤(Glioblastoma multiforme, GBM)是成人颅内常见原发恶性肿瘤,由于肿瘤广泛侵袭周围正常脑组织,肿瘤全切困难。尽管通过手术、放疗、化疗等综合治疗手段,其预后仍然不佳,患者总体中位生存期在14-16个月。对于GBM侵袭的分子机制,国内外学者进行了大量的研究。受体酪氨酸激酶信号通路、细胞外基质蛋白分子和细胞跨膜蛋白分子起了重要作用。细胞周期依赖性激酶相关磷酸酶(cyclin-dependent kinase-associated phosphatase,KAP)通过Cdc2依赖的侵袭途径促进GBM的侵袭。KAP是一双重特异性磷酸酶,通过去磷酸化Cdk2,抑制Cdk2的活性和细胞周期的进展。在乳腺癌、前列腺癌和肝癌中,KAP表达上调可增加肿瘤形成。假定KAP抑制细胞周期的进展,其上调增加肿瘤形成的机制难以解释。来自于肝细胞癌的研究可能解释这种现象,在肝细胞癌中,虽然KAP mRNA表达增加,但由于异常剪接的KAP mRNA编码缺乏Cdk2去磷酸化活性的KAP蛋白,导致大量无功能的KAP蛋白生成。在GBM中,KAP mRNA表达增加,但由于剪接异常,实际上产生大量无功能性KAP蛋白。KAP活性降低导致Cdc2表达上调,同时应用Cdc2抑制剂可拮抗GBM细胞的增殖和迁移过程。但是,KAP如何调节Cdc2依赖的GBM侵袭途径,其详细机制仍然未明。除剪接外,基因表达的后转录调节可影响KAP蛋白的表达。微小RNA(MicroRNA,miRNA)是一种内源性非编码RNA,长度一般为20-25个核苷酸,其通过与靶基因的mRNA 3’UTR互补结合,影响蛋白的翻译,因此,在后转录水平下调基因的表达。MiRNA通过与增殖和侵袭的相关基因靶向性结合,调节这些蛋白的表达,进而调节肿瘤的增殖、侵袭和转移。此前报道,mir-26a基因在GBM中高表达,其通过与PTEN、RB1、MEKK2等抑癌基因靶向结合,下调其表达促进GBM细胞的增殖和侵袭。在肺癌中miR-26a通过与PTEN的3’UTR靶向性结合促进肺癌的侵袭及转移,这种现象也可能存在GBM细胞系中。但在鼻咽癌和肝细胞癌中,miR-26a可抑制肿瘤侵袭和转移。因此,miR-26a对侵袭的作用具有组织特异性,miR-26a对GBM侵袭能力如何调节,其在PTEN突变／缺失的GBM中的靶点和作用机制如何,国内外文献未见相关报道。本文显示miR-26a直接与KAP mRNA 3’UTR靶向性结合,在后转录水平下调KAP蛋白表达。同时KAP蛋白表达减少激活两条不同的途径,最终导致Cdc2蛋白表达增加,促进GBM细胞的侵袭过程。一条途径为KAP降低导致ROCK2减少,ROCK2减少直接激活Racl依赖的侵袭途径；另一条途径为KAP降低直接激活CDK2, CDK2去磷酸化Rb使Rb基因失活进而激活转录因子E2F,E2F直接激活Cdc2依赖的侵袭途径。因此,miR-26a通过KAP/ROCK2/CDK2途径促进GBM细胞侵袭,我们发现验证miR-26a靶向性结合的新的基因位点,这一调节在PTEN缺失的GBM中发挥重要作用,同时我们发现KAP在GBM侵袭中的作用和具体机制。实验目的细胞周期依赖性激酶相关磷酸酶(KAP)通过Cdc2依赖的调节GBM细胞侵袭,然而,KAP调节Cdc2依赖侵袭通路的详细机制仍然未明。我们通过KAP免疫共沉淀结合蛋白质谱分析的方法,筛选与KAP密切相关的Rho激酶家族成员ROCK1,ROCK2,ROCKβ,验证KAP/ROCK2/Racl依赖性的GBM侵袭通路。同时阻断上述通路并不能完全阻断GBM细胞的侵袭能力。进一步实验发现KAP下调直接激活CDK2表达使Rb去磷酸化进而激活转录因子E2F,E2F激活Cdc2依赖的侵袭途径,验证KAP/CDK2/Cdc2侵袭途径。同时检测miR-26a在PTEN突变／缺失的GBM中的作用,通过预测发现miR-26a能与KAP mRNA3’UTR种子区域结合,验证miR-26a是否在后转录水平调节直接下调KAP蛋白表达,通过上述通路激活Cdc2依赖的GBM侵袭途径。方法1) 采用原代培养GBM细胞从标本中分离、培养胶质瘤干细胞(glioma stem cells, GSCs)并移植到裸鼠脑内,应用Cdk2/Cdc2抑制剂治疗后观察GSCs的迁移距离；应用直接表达miR-26a的细胞株植入裸鼠脑内,观察其侵袭能力。2) 构建并克隆KAP高表达质粒,shKAP, miR-26表达质粒及相应对照质粒,应用脂质体转染并包装成具有感染能力的慢病毒,应用浓缩后的病毒上清感染GBM细胞系U87、U251和LN229,应用压力选择制备稳定表达上述基因或miRNA的细胞系。3) 采用免疫细胞化学的方法对处理的细胞进行染色鉴定KAP和ROCK1/2在胞内的表达部位；鉴定细胞侵袭有关的丝状伪足的多少。4) 应用Real-time PCR检测不同条件处理的细胞中KAP,miR-26a的表达情况。5) 应用western Blot检测miR-26a下游KAP,ROCK1/2>ROCKβ、Rac1、CDK2、 CDK4、CDK6、Rb及其不同的磷酸化位点,Cdc2、pCdc2、CyclinD1、 Cadesman等的表达情况。6) 应用Transwell检测IniR-26a表达和KAP表达对GBM细胞侵袭能力的影响。7) 构建荧光素酶报告基因KAP mRNA 3’UTR和KAP mRNA 3’UTR突变位点,检测1niR-26a 与KAP mRNA 3’UTR种子区域直接结合的能力。8) 应用Rac1活性试剂盒测定miR-26a和KAP对Racl激活能力的影响。应用ROCK2活性测定试剂盒检测ROCK磷酸化活性位点。结果1) KAP可与ROCK2,ROCK1, ROCKβ直接结合,KAP蛋白表达下调同时减少与之结合的ROCK2蛋白可激活下游的Racl蛋白。2) KAP蛋白表达下调直接激活CDK2蛋白表达上调使Rb去磷酸化进而激活转录因子E2F,E2F直接激活Cdc2依赖的GBM细胞侵袭通路。3) KAP表达下调和ROCK抑制也增加Caldesman磷酸化,证实KAP调节细胞的迁移活性通过调节Caldesman的活性。4) 应用Cdk2和Cdc2的小分子抑制齐Jpurvalanol A阻断KAP依赖的侵袭途径,结果发现purvalanol A在体外能够明显减少GSCs的侵袭能力。5) miR-26a可通过与PTEN mRNA 3’UTR靶向结合通过Akt途径促进GBM细胞侵袭,在PTEN缺陷的GBM细胞系U251和U87中可通过下调KAP表达,激活Cdc2依赖的GBM通路。6) miR-26a通过与KAP mRNA 3’UTR靶向性结合促进GBM的侵袭,KAPmRNA 3’UT Rf中子区域内两个碱基改变可消除这种靶向结合。结论1)miR-26a直接与KAP mRNA 3’UTR靶向性结合导致KAP蛋白表达减少。2) 同时KAP减少激活两条不同的途径,最终导致Cdc2蛋白表达增加,促进GBM细胞的侵袭能力。3) 一条途径为KAP降低导致ROCK2减少,ROCK2减少直接激活Racl依赖的侵袭途径,进而激活Cyclin D1表达增加；4) 另一条途径为KAP降低直接激活CDK2,CDK2去磷酸化Rb使Rb基因失活进而激活转录因子E2F,E2F激活Cdc2依赖的GBM细胞侵袭通路。5) miR-26a通过KAP/ROCK2/CDK2通路促进GBM细胞侵袭及细胞周期进展,这一途径是不依赖PTEN的新的miR-26a靶点和新的GBM细胞侵袭途径。