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小菜蛾是十字花科植物的主要害虫,也是研究昆虫抗药性的模式昆虫。本文通过研究抗性(抗毒死蜱品系)、敏感小菜蛾(幼虫、蛹以及成虫)在不同高温条件下线粒体凋亡路径基因和Hsp家族基因表达量的差异,从分子水平上揭示高温条件下抗性与敏感小菜蛾之间的适合度关系以及高温影响抗性小菜蛾种群ace1基因型频率的原因。凋亡体(Cytochrome c-Apaf-1-procaspase-9)在线粒体凋亡路径中发挥重要作用。本文首次从小菜蛾中克隆到组成凋亡体的3个蛋白基因,分别为cytochrome c,Apaf-1和caspase-9。其中,Apaf-1有两个mRNA亚型,即Apaf-1a和Apaf-1b。小菜蛾cytochrome c(GenBank:KC507801)cDNA序列长873 bp,含有一个327 bp的完整开放阅读框(ORF),编码108个氨基酸,蛋白分子量为11.74 kDa,等电点为9.62。Apaf-1a(GenBank:KC588901)cDNA序列长5054bp,含有一个4647 bp的完整ORF,编码1548个氨基酸,蛋白分子量为175.96kDa,等电点为 6.85。Apaf-1b(GenBank:KF318722)cDNA 序列长 4981 bp,含有一个4647 bp的完整ORF,编码1548个氨基酸,蛋白分子量和等电点分别为175.96 kDa和6.85。Apaf-1a和Apaf-1b具有共同的ORF(4647bp)和5’-非翻译区(172bp)序列,但Apaf-1a在3’-非翻译区比Apaf1b长73 bp。Apaf-1a和Apaf-1b的氨基酸序列同源性为100%。小菜蛾caspase-9(GenBank:KF365914)ORF序列长1356bp,编码451个氨基酸,蛋白分子量为51.33 kDa,等电点为7.56。本文从小菜蛾中克隆到3条hsp70cDNA序列,分别为hsp72-1a,hsp72-1b和hsc70。其中,hsp72-1a 和hsp72-1b 属于诱导型 hsp70,hsc70 属于组成型hsp70。hsp72-1a(GenBank:JQ693015.1)ORF序列长1992 bp,编码663个氨基酸,蛋白分子量为72.16 kDa,等电点为 5.27。hsp72-1b(GenBank:JQ711194.1)ORF 序列长 1992 bp,编码 663 个氨基酸,蛋门分子量为 72.13 kDa,等电点为 5.34。hsc70(GenBank:JN676213.1)ORF 序列长 1953 bp,编码650个氨基酸,蛋白分子量为71.18kDa,等电点为5.26。hsp72-1a,hsp72-1b和hsc70的氨基酸序列均含有Hsp70家族的三段高度保守序列以及ATP/GTP结合位点和核定位信号位点。小菜蛾幼虫、成虫经37和42℃热激诱导3 h后,线粒体凋亡路径基因(cytochrome c,Apaf-1,caspase-9和cas/pase-7)mRNA表达量升高,而且总体上这些基因在抗性小菜蛾中的上调表达幅度高于在敏感小菜蛾中的上调表达幅度。小菜蛾蛹经38℃诱导48 h、40℃诱导8和16 h、42℃诱导4和8 h以及44℃诱导1 h后,上述4个线粒体凋亡路径基因mRNA表达量均升高,而且caspase-9和caspase-7在抗性小菜蛾中的上调表达幅度显著高于在敏感小菜蛾中的上调表达幅度。高温(33.5-50℃ 3 h)能够诱导小菜蛾成虫Apaf-1,caspase-9和caspase-7基因上调表达,而且随着处理温度的升高,这3个基因的表达量均呈现先升高后降低的趋势,最高值一般在42或47℃。高温(40℃)能够诱导小菜蛾成虫Apaf-1,caspase-9和caspase-7基因上调表达,在24、48和72 h处理中,随着处理时间的延长,这3个基因的表达量均呈现先升高后降低的趋势(caspase-7呈现逐渐降低的趋势);另外,caspase-9和caspase-7在抗性小菜蛾中的上调表达幅度高于在敏感小菜蛾中的上调表达幅度。细胞凋亡检测发现,高温(40℃)能够诱导抗性与敏感小菜蛾发生细胞凋亡,而且抗性小菜蛾的凋亡程度高于敏感小菜蛾。hsc70的基础表达水平很高,但高温不能显著诱导hsc70基因上调表达。诱导型hsp 70s、hsp90和hsp20的基础表达水平很低,但经高温诱导后,这些基因的表达量显著升高。小菜蛾幼虫、成虫经高温(37和42℃)诱导3h后,诱导型hsp70s、hsp90和hsp20的表达量均显著升高,而且42℃时的表达量显著高于37℃时的表达量;另外,上述这些基因在敏感小菜蛾中的上调表达幅度高于抗性小菜蛾。小菜蛾蛹经38℃诱导48 h、40℃诱导8和16 h、42℃诱导4和8 h以及44℃诱导1 h后,诱导型hsp70s、hsp90和hsp20的表达量均显著升高;在25℃条件下,上述这些基因在抗性小菜蛾中的表达量高于敏感小菜蛾,然而在热激条件下,这些基因在敏感小菜蛾中的表达量却高于抗性小菜蛾。高温(33.5-50℃ 3 h)能够诱导小菜蛾成虫诱导型hsp70s、hsp90和hsp20基因上调表达,而且随着处理温度的升高,这些基因的表达量均呈现先升高后降低的趋势,最高值一般在42或47℃。高温(40℃)能够诱导小菜蛾成虫诱导型hsp70s、hsp90和hsp20基因上调表达,在24、48和72h处理中,随着处理时间的延长,这些基因的表达量呈现先升高后降低或逐渐降低的趋势。总的来说,高温能够诱导诱导型hsp70s、hsp90和hsp20基因上调表达,而且这些基因在敏感小菜蛾中的上调表达幅度高于抗性小菜蛾。在脱离杀虫剂选择压力下,随着饲养代数的增长,抗性小菜蛾种群ace1Gly227A1a突变位点RR基因型频率逐渐下降,但高温能够加速RR基因型频率的急剧下降。另外,田间抗性小菜蛾种群在夏季时RR基因型频率急剧下降、显著低于春秋两季。