第一部分E3泛素连接酶SCFβTrCP介导的DYRK1A蛋白降解对细胞周期的调控作用研究背景唐氏综合征(DS)是人类最常见的遗传性疾病之一。患者的神经系统发育受损,而且绝大多数病人会罹患早发性阿尔茨海默病。研究认为神经干细胞的自我更新异常在DS和AD的发病机制中具有重要作用。DYRK1A基因定位于21号染色体上一段名为唐氏综合征关键区域的序列,被认为参与了DS及AD的病理过程。DYRK1A基因编码的蛋白具有磷酸激酶活性,其底物包括多种细胞周期蛋白如CyclinD1、p21和p27等。DYRK1A过表达可阻滞神经前体细胞的细胞周期,促进细胞分化。由于DYRK1A具有很强的基因剂量效应,因此翻译后修饰和调控对于维持DYRK1A蛋白的正常水平具有重要作用。虽然DYRK1A对细胞增殖和分化有重要作用,但是DYRK1A蛋白水平在细胞周期内的变化及调控机制仍不清楚。蛋白复合体SCFβTrCP是目前唯一确认具有底物特异性的E3泛素连接酶,βTrCP亚基能特异性的与靶蛋白上的D(p)SGXX(p)S序列结合,使蛋白泛素化并通过蛋白酶体途径降解。SCFPTrCP通过介导CDC25A/B、DEPTOR和Weel等蛋白降解调节细胞增殖。研究发现PTrCP在细胞增殖不同时期蛋白水平有明显差异,并呈现出一定的规律性,表明SCFPTrCP对细胞周期有重要的调控作用。研究目的研究DYRK1A和βTrCP在细胞周期中的表达和变化规律,确定SCFβTrCP介导DYRK1A降解的分子机制。研究方法1.研究DYRK1A是否通过泛素-蛋白酶体途径降解：向Hek293中转染DYRK1A表达质粒pDYRK1A-flag-myc,用系列浓度的Lac (lactacystin)处理24小时或用2.0μMLac处理不同时间,western blot检测DYRK1A蛋白含量,或用CHX chase assay检测DYRK1A降解速率的变化；将pDYRK1A-flag-myc和泛素的表达质粒pUbi-his共转染入Hek293细胞,通过co-IP实验,分别以泛素抗体或flag抗体和protein A/G富集蛋白,检测被泛素化的DYRK1A蛋白；2.研究E3泛素连接酶SCFβTrCP是否参与DYRK1A的降解过程：将pDYRK1A-flag-myc与βTrCP的表达载体pβTrCP-flag共转染至Hek293细胞,通过co-IP实验检测二者是否存在相互作用；合成PTrCP的siRNA干扰片段,将其与pDYRK1A-flag-myc共转染至Hek293细胞,western blot检测DYRK1A蛋白含量；构建Cullinl和Cullin2的负显性抑制载体(SCFPTrCP的竞争性抑制因子),分别将其与pDYRK1A-flag-myc共转染至Hek293细胞,western blot检测DYRK1A蛋白含量；构建敲除βTrCP的Hek293细胞系,通过CHX chase assay检测DYRK1A半衰期的变化；将βTrCP的干扰片段或ppTrCP-flag分别与pDYRK1A-flag-myc共转染至Hek293细胞,通过co-IP实验检测DYRK1A泛素化水平的变化。3.确定导致DYRK1A降解的蛋白结构域：构建一系列DYRK1A的截短突变体,通过CHX chase assay比较各突变体的半衰期与野生型DYRK1A的区别。4.确定DYRK1A蛋白中与βTrCP结合的氨基酸序列：将DYRK1A的截短突变体与ppTrCP-flag转染至Hek293细胞中,co-IP检测突变体与PTrCP的相互作用；构建DYRK1A蛋白N端的截短突变体,通过co-IP实验检测其泛素化水平的变化,通过CHXchase assay检测其半衰期的变化。5.确定DYRK1A蛋白序列中的降解决定子：构建DYRK1A的点突变载体,用CHXchase assay检测其降解速率的改变,通过co-IP实验检测其泛素化水平及其与βTrCP结合能力的变化；将pDYRK1A-flag-myc或其N端表达载体与pβTrCP-flag共转染至Hek293细胞,提取蛋白后用λ-PPase处理,co-IP检测DYRK1A或其N端与βTrCP的结合。6.研究细胞周期中SCFβTrCP对DYRK1A的调控作用：用Nocodazole处理Hek293细胞,将细胞周期同步于G2/M期；之后将细胞放在未加药的培养基中培养,在之后0-24小时内每隔2小时收集细胞,流式细胞术检测细胞周期,western blot检测DYRK1A和βTrCP蛋白在细胞周期中的变化,real-time qRT-PCR检测细胞周期中DYRK1A mRNA的变化；在βTrCP低表达细胞内敲除DYRK1A,观察细胞周期的变化。研究结果1.DYRK1A通过泛素-蛋白酶体途径降解：用Lac处理Hek293细胞后,DYRK1A的蛋白水平随药物浓度及作用时间的增加而升高,其降解速率明显变慢；在co-IP实验中,无论是用泛素抗体或flag抗体用做IP抗体,均能检测到被泛素化的DYRK1A。2.E3泛素连接酶SCFβTrCP参与DYRK1A的降解过程：通过co-IP实验,证明了DYRK1A和βTrCP之间存在相互作用；当Hek293细胞内的βTrCP被敲除时,细胞内DYRK1A的蛋白含量增加,半衰期变长；Cullinl和Cullin2的负显性抑制载体能明显增加Hek293细胞内DYRK1A的蛋白水平；当在Hek293细胞内敲除或高表达βTrCP时,DYRK1A的泛素化水平分别明显下降和升高。3. DYRK1A蛋白的N端决定DYRK1A降解：通过CHX chase assay我们发现当截掉DYRK1A蛋白的PEST富集区、C端或只保留C端时,其降解速率与全长DYRK1A蛋白没有明显区别,但DYRK1A的N端表现出显著的不稳定性,在细胞内极易被降解。4.DYRK1A的N端34-71氨基酸残基序列中存在βTrCP的结合位点：我们通过co-IP实验发现βTrCP与DYRK1A蛋白的N端结合：我们进一步构建了DYRK1A蛋白的N端内截短突变体,发现DYRK1A蛋白的N端34-71氨基酸残基序列中存在βTrCP的结合位点,并且当DYRK1A缺少N端34-71氨基酸残基时,其半衰期明显延长,泛素化水平也明显降低。5. DYRK1A蛋白N端的49SDQQVSALS57残基序列是其降解决定子：通过CHXchase assay,我们发现相对于野生型蛋白,S49A、S54A和S57A点突变体的降解速率均明显变慢,而S59A点突变体的降解速率没有明显变化；co-IP实验也验证了类似的结果,与野生型相比49A、S54A和S57A点突变体与βTrCP的结合能力明显减弱,泛素化水平降低,而S59A点突变体与βTrCP的结合能力及其泛素化水平没有显著变化；经过λ-PPase处理后,DYRK1A或其N端与PTrCP的结合能力均明显下降。6.SCFβTrCP在细胞周期中调控DYRK1A的蛋白水平：流式细胞术结果表明,经过Nocodazole处理,细胞被阻滞在G2/M期,加入新培养基后细胞周期被激活；在细胞周期中DYRK1A的mRNA水平没有明显变化,其蛋白水平在S期和G2/M期显著下降；βTrCP在细胞周期中的变化规律与DYRK1A相反,呈负相关关系；下调DYRK1A蛋白水平可有效逆转敲除PTrCP引起的G0/G1阻滞。结论1.E3连接酶SCFβTrCP介导DYRKIA通过泛素-蛋白酶体途径降解。2. DYRKIA蛋白N端的49SDQQVSALS57序列是SCFβTrCP的结合位点。3. SCFβTrCP介导DYRKIA蛋白降解维持细胞周期的正常进行。第二部分DYRK1A通过下调c-Myc调节AML细胞增殖和耐药研究背景急性髓性白血病(AML)是由造血前体细胞分化障碍和异常增殖引起的恶性疾病,是成人中发病率最高的急性白血病类型。虽然随着医学的进步,AML的治疗手段得到极大改善,但鲜有治愈,其五年生存率仍不容乐观。AML治疗的最大障碍是缺乏有效的靶向药物及耐药,因此充分了解AML的发病机制对于发展新的治疗手段具有决定性的意义。目前,AML的分子病理机制尚未完全明确,除公认的基因突变外,研究显示抑癌基因和癌基因的异常表达也在AML的发病过程中起重要作用。DYRK1A基因定位于21号染色体唐氏综合征关键区域,在唐氏综合征的病理过程中起重要作用。与正常人相比,唐氏综合征患者的实体肿瘤及多型白血病的发病率明显下降,因此DYRK1A被普遍认为具有抗肿瘤效应。DYRK1A是一种蛋白激酶,可使其底物的丝氨酸或苏氨酸残基发生磷酸化。DYRK1A的多个底物与肿瘤的发生、转移和耐药及细胞增殖和分化切相关,但DYRK1A在AML中的作用及相关分子机制尚不明确。c-Myc是一种经典的癌基因,其编码的蛋白主要参与调控细胞增殖和分化。在病理条件下,c-Myc蛋白异常高表达,使细胞周期缩短,分化受到抑制,并最终导致细胞恶性增殖。研究表明,c-Myc在AML病人中高表达,治疗缓解后表达下降,复发时表达回升,表明c-Myc与AML存在密切联系,提示降低c-Myc的蛋白水平对于AML的治疗具有重要意义。除转录翻译外,c-Myc的蛋白水平还受到蛋白降解作用的调控。c-Myc的降解主要通过泛素-蛋白酶体途径进行,磷酸化在此过程中起决定作用,因此发现能磷酸化c-Myc的蛋白激酶有助于充分了解AML的发病机制。研究目的研究DYRKIA在AML病人中的表达情况,探索DYRK1A对AML细胞增殖和耐药的作用,阐明DYRK1A对c-Myc蛋白的作用和分子机制,为AML靶向药物的研发提供理论依据。研究方法1.检测AML患者体内DYRK1A的mRNA水平：收集初诊(55例)和复发(16例)的AML患者及正常人的骨髓标本,采用Ficoll-Hypaque方法分离单个核细胞,采用Trizol试剂分离RNA,反转录后采用SYBR Green Real-time qPCR检测各样本中DYRK1A的mRNA水平。2.研究DYRK1A对AML细胞增殖的影响：用DYRK1A慢病毒颗粒感染AML细胞系,采用SYBR Green Real-time qRT-PCR方法确定DYRK1A成功过表达；为了研究DYRK1A对AML细胞增殖的影响,我们采用MTT方法绘制细胞生长曲线,采用流式细胞术确定细胞周期的变化,同时我们还检测了p21、cyclin D1和CDK2等细胞周期蛋白的水平；为了排除细胞凋亡对实验结果的影响,我们采用annexin V-PE/7-AAD双染色方法检测了细胞凋亡水平。3.研究DYRK1A对c-Myc的作用及分子机制：我们在AML细胞中过表达DYRK1A,分别采用western blot和SYBR Green Real-time qRT-PCR检测了c-Myc的蛋白和mRNA的变化；为了研究DYRK1A能否促进c-Myc蛋白降解,我们在Hek293细胞中转染DYRK1A,通过western blot检测c-Myc的半衰期和Ser62及Thr58的磷酸化水平；为了进一步证明DYRK1A是否直接磷酸化c-Myc,我们采用co-IP方法验证DYRK1A和c-Myc的结合作用。4.研究DYRK1A是否通过c-Myc影响AML细胞的增殖：为了证明DYRK1A是否通过磷酸化c-Myc调控AML细胞的增殖,首先我们采用干扰载体下调c-Myc的mRNA和蛋白后,检测细胞增殖相关指标,如cyclin D1、CDK2和p21的表达水平；我们进一步在DYRK1A过表达的细胞系中同时过表达c-Myc,观察细胞增殖及细胞周期蛋白cyclin D1和p21的变化。5.研究DYRK1A在AML细胞耐药中的作用：我们在HL-60/ADM中过表达DYRK1A,然后用不同浓度的阿霉素处理细胞72小时；我们采用MTT方法检测不同处理时间HL-60/ADM的生存率,采用annexin V-PE/7-AAD双染色方法检测细胞的凋亡率。研究结果1.AML患者体内DYRK1A的mRNA水平显著偏低：我们通过real-time qRT-PCR发现AML患者体内DYRK1A的mRNA水平明显低于正常人群,而且与初诊的AML患者相比,复发的AML患者体内DYRK1A的mRNA水平显著下降。2.过表达DYRK1A明显抑制AML细胞的增殖：在细胞系HEL、HL-60和NB4中过表达DYRK1A后,其增殖速率明显受到抑制；通过流式细胞术我们发现DYRK1A过表达可明显降低处于S期而显著升高处于G0/G1期的细胞比例；与之相对应,我们发现过表达DYRK1A的细胞中p21蛋白水平明显升高,而cyclin D1和CDK2的蛋白水平明显下降；通过流式细胞术我们发现DYRK1A过表达对细胞凋亡和死亡影响甚微,排除了细胞凋亡对实验结果的影响。3. DYRK1A通过磷酸化促进c-Myc降解：我们发现DYRK1A过表达可显著升高c-Myc的蛋白而非mRNA水平,且明显降低c-Myc的降解速率；我们进一步证明DYRK1A可有效升高与c-Myc降解密切相关的Ser62及Thr58残基的磷酸化水平；通过co-IP实验,我们证明DYRK1A可与c-Myc相结合。4. DYRK1A通过降低c-Myc影响AML细胞的增殖：在HEL细胞系中敲除c-Myc后,p21的mRNA水平显著增加105.36±42.94%,而cyclin D1的mRNA水平则显著下降49.53±2.43%；癌基因c-Myc的过表达有效逆转由DYRK1A过表达引起的增殖抑制及p21蛋白水平的升高和cyclin D1蛋白水平的下降。5. DYRK1A过表达显著增强AML细胞的药物敏感性：我们建立了过表达DYRK1A的HL-60/ADM细胞系,命名为HL-60/ADM-DYRK1A; HL-60/ADM-DYRK1A细胞系阿霉素IC50为0.9389±0.063 mg/L,显著低于对照细胞系(IC50为2.3144±0.58299mg/L)；与之相一致,阿霉素处理后HL-60/ADM-DYRK1A的凋亡率明显升高。结论1.DYRK1A对AML细胞增殖具有抑制作用。2. DYRK1A通过磷酸化Ser62残基促进c-Myc降解。3.DYRK1A通过介导c-Myc降解发挥抑癌作用。