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第一部分流式-荧光原位杂交（Flow-FISH）技术破膜条件的优化目的:建立适合与优化的流式-荧光原位杂交技术（Flow-FISH）的固定与破膜条件。方法:通过Ficoll-paque离心分离法收集重庆医科大学附属儿童医院招募患者外周血标本中单个核细胞,每组取细胞5x10~5-1x10~6,将细胞膜染、固定后,使用Triton X-100、Saponin、Tween-20、Thermo Fisher成品破膜试剂盒分别对细胞进行不同浓度及时间处理,经过流式细胞仪和共聚焦显微镜检测破膜剂对细胞形态、表面抗原的影响及破膜剂的破膜效力,寻找最优的破膜条件。结果:成功建立适合Flow-FISH技术的破膜条件,分别使用0.05%、0.1%、0.2%、0.4%的Tween-20对细胞处理10min、15min、20min,通过流式细胞仪检测发现使用0.2%Tween-20对细胞进行破膜处理15min后细胞前向散射（FSC）和侧向散射（SSC）数值变化不大,细胞形态保持完好,细胞亚群能正常分群,细胞表面抗原完好。在Tween-20破膜后加入Annexin V抗体。由于Annexin V位于活细胞内测,在细胞完整的情况下不存在Annexin V阳性,当0.2%Tween-20破膜15 min后,100%细胞Annexin V阳性,在共聚焦显微镜下观察,发现0.2%Tween-20破膜15min后细胞形态完整,Annexin V荧光特异性分布于胞内。进一步验证了使用0.2%Twenn20破膜15min之后不会对细胞形态以及表面抗原产生影响,可作为最佳破膜条件。结论:以0.2%Tween-20破膜15min作为破膜条件,对细胞形态及表面抗原影响小,并且有足够强的破膜效力满足抗体分子进入细胞与抗原结合,同时不会造成小分子物泄露。适合作为Flow-FISH技术的破膜条件。第二部分Flow-FISH技术杂交条件的优化目的:建立与优化适用于流式细胞仪检测Flow-FISH技术的杂交条件。方法:细胞进行膜染、固定、破膜处理后,将细胞与探针在传统和优化后杂交液中进行杂交后,使用流式细胞仪进行检测;将细胞膜染、固定、破膜后分别在4℃、室温与37℃过夜、56℃1 h和3 h条件下杂交后使用流式细胞仪进行检测;在杂交完成分别使用磷酸盐缓冲液（PBS）和柠檬酸钠缓冲液（SSC）对杂交完成的细胞清洗后,使用流式细胞仪进行检测。结果:在传统杂交液中杂交之后使用流式细胞仪检测发现SSC变窄、FSC变宽,而优化后的杂交液FSC与SSC变化小。传统杂交液将荧光强度提高到了99.9%,优化后的杂交液将荧光强度提高到99.8%,二者无显著差异。将细胞固定破膜后分别在4℃、37℃与室温过夜、56℃1h和3h的条件下杂交,流式细胞仪检测结果表明上述条件下FCS、SSC基本不变。杂交完成之后使用不同浓度杂交洗液SSC洗液对细胞反复清洗,流式细胞仪检测结果显示与PBS相比经SSC洗涤后细胞FSC与SSC变化小,T/B/NK细胞亚群分群清晰。结论:使用优化后的杂交液,在各杂交条件下杂交均不会对细胞状态产生明显影响,且不影响流式细胞仪对细胞表面标志物表达的检测,可作为Flow-FISH技术的杂交液。在4℃、37℃与室温过夜、56℃1h和3h条件下杂交均不会对细胞形态产生影响。使用浓度递减的SSC对杂交后的细胞进行洗涤不会对细胞大小形态及表面抗原产生影响,可用于进一步实验。第三部分Flow-FISH技术在EBV感染+/-细胞中的应用目的:为了验证Flow-FISH技术能否鉴别诊断出EBV+细胞系:RAJI、B95-8;EBV-细胞系:MOLT3、SUP-B15,以及外周血单个核细胞（PBMC）中EBV+/-的细胞亚型。方法:利用qRT-PCR验证EB病毒编码的小RNA（EBERs）在EBV+/-细胞系的表达情况。利用Flow-FISH技术检测EBV+细胞系及其亚型,在EBV-DNA+及EBV-DNA-的病人外周血中提PBMC取后,Flow-FISH技术检测EBV+细胞及其亚型。将Flow-FISH技术检测后剩下的B95-8细胞标本滴涂在黏附玻片上,避光封片,使用共聚焦显微镜拍摄;将RAJI细胞系和MOLT3细胞系按不同比例混合后使用Flow-FISH技术检测混合细胞中RAJI细胞系的比例,计算与判断Flow-FISH技术灵敏度。结果:qRT-PCR结果表明在EBV+细胞系:RAJI、B95-8中EBERs的表达量高于EBV-细胞系:SUP-B15,对B95-8进行共聚焦拍摄,结果表明,细胞形态完整、荧光特异性位于胞内。流式细胞仪检测结果显示Flow-FISH技术能鉴定出EBV+细胞系:RAJI、SUP-B15细胞中EBV+细胞,并能鉴别出RAJI细胞系中EBV+细胞的亚型为CD19+。对B95-8细胞系进行共聚焦拍摄,结果表明,细胞形态完整、荧光特异性位于胞内。对Flow-FISH技术灵敏度进行验证时发现将RAJI细胞系与MOLT3细胞系按0:1、1:99、1:9、5:5、7:3、1:0进行混合之后,使用Flow-FISH技术对其进行验证,流式细胞仪检测结果显示EBV+细胞百分率分别为:0%、0.95%、9.54%、45.6%、65.4%、94.7%,表明Flow-FISH技术能灵敏的鉴定出细胞混合液中的阳性细胞的比例。使用Flow-FISH技术检测EBV-DNA+以及EBV-DNA-患者PBMC,结果表明Flow-FISH技术能鉴别诊断出PBMC中EBV+细胞及其亚型。结论:Flow-FISH技术以EBERs作为目标RNA,能特异灵敏的检测出EBV+的细胞系亚型,并能鉴别临床患者外周血中EBV感染的细胞同时判断其亚型。