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研究背景及目的肿瘤的生长与转移依赖于血管生成,在调控肿瘤血管生成的诸多因子中,血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）及其受体（vascularendothelial growth factor receptors,VEGFRs）在促进肿瘤血管生成中起关键作用。VEGF通过与细胞表面VEGFR的胞外区结合,激活下游信号分子,发挥促血管生成活性。VEGF主要通过与VEGFR家族中的VEGFR2（KDR/flk-1）结合发挥促血管生成作用。KDR生理情况下主要表达于增生的血管内皮细胞;病理情况下,KDR在多种肿瘤组织中的表达均上调。因此,KDR成为肿瘤血管生成核素显像及治疗的重要靶点之一。VEGF包含7个外显子序列,不同外显子编码的多肽片段与KDR的亲和力不尽相同。研究证实,外显子6编码的12肽QKRKRKKSRYKS与KDR结合的亲和力强于其他同类多肽片段,但该多肽无生物学活性,故可竞争抑制VEGF的促血管生成活性。因此,多肽QKRKRKKSRYKS有望替代完整的VEGF分子用于肿瘤的靶向显像与治疗研究。截短KDR是胞内酪氨酸激酶区缺失,却保留了与VEGF结合位点的胞外区和跨膜区的KDR重组体,因其无促血管生成的作用,若提高其在肿瘤组织中的表达,一方面可介导更多的放射性核素标记的VEGF多肽聚集于肿瘤组织,增强肿瘤的核素显像及治疗效果,另一方面还因其具有抗血管生成作用而发挥靶向双效抗肿瘤作用,为进一步核素治疗奠定实验基础。本研究旨在探讨QKRKRKKSRYKS的188Re标记方法,标记多肽在荷瘤裸鼠的体内分布及SPECT肿瘤靶向显像;并探讨肿瘤组织转染截短KDR基因对标记多肽肿瘤显像的影响,为进一步的肿瘤靶向治疗奠定实验基础。研究方法1.多肽QKRKRKKSRYKS的MAG3偶联及188Re标记:改进偶联方法,在多肽的合成过程中直接对N端行巯基乙酰化修饰,完成多肽与MAG3的偶联,并采用正交设计法筛选188Re的最佳标记条件。2.188Re-MAG3-QKRKRKKSRYKS的纯化及鉴定:Sep Pak C18柱层析纯化及HPLC鉴定标记多肽,纸层析法测定标记率及放化纯度,计算放射性比活度,鉴定标记物室温下及血清中的稳定性,体外竞争结合实验鉴定标记多肽的受体结合活性。3.188Re-MAG3-QKRKRKKSRYKS的示踪动力学:5只日本大耳兔静注37 MBq/只标记物后,分别于1.5,3.0,5.0,10,30,60,90,120,180和300 min采血测定其放射性计数,经DAS2.0软件处理获得房室模型并计算动力学参数。4.188Re-MAG3-QKRKRKKSRYKS的荷瘤裸鼠体内分布及显像研究:荷SKOV3卵巢癌裸鼠,尾静脉注射标记物（18.5 MBq/只,每组5只）,分别于注射后30 min、60min及2 h采集血液、心、肝、脾、肺、肾、胃、肠、脑、甲状腺、肿瘤及肌肉组织,称重并测定放射性计数,计算每克组织百分注射剂量率（%ID/g）,并计算肿瘤与非肿瘤组织比值（T/NT）。荷瘤裸鼠注射标记物（18.5 MBq/只）后1 h、3 h行SPECT平面预置计时（10 min）显像。5.肿瘤组织转染截短KDR基因后对荷瘤裸鼠肿瘤显像的影响:截短KDR腺病毒转染荷SKOV3卵巢癌裸鼠的肿瘤组织,48 h后肿瘤组织冰冻切片证实截短KDR的表达,注射标记多肽后1 h行SPECT显像,结果与未转染组比较。实验结果1.多肽的合成及与MAG3的偶联:简化了偶联步聚,提高了偶联产率,分子量的理论值为1879.04,质谱分析值为1880.9。2.正交设计筛选188Re的最佳标记条件如下:0.25 M pH 5.2的醋酸铵缓冲液30μL,7μL预锡化处理后的多肽20μg,新鲜的188ReO4-淋洗液的放射性活度37 MBq,55 g/L的酒石酸钾钠溶液10μL,5 g/L的SnCl2（20 mM HCl新鲜配制,含1 g/L抗坏血酸）20μL,双蒸水补充总体积至110μL,调节pH值至4.6,充氮密封,100℃水浴中反应60 min。3.在上述标记条件下多肽的188Re标记率为73.1%±5.45%,标记物的平均放射性比活度为2.594 TBq/mmol,标记混合物经Sep Pak C18纯化后放化纯度＞95%,室温放置24 h放化纯仍＞90%,血清中温育3 h后放化纯度仅下降4%,EA.hy926、SKOV3以及A549多种细胞受体竞争结合实验表明188Re-MAG3-QKRKRKKSRYKS保持了较好的受体结合活性。4.188Re-MAG3-QKRKRKKSRYKS在健康日本大耳兔体内的示踪动力学符合权数为1/cc的三室模型。5.体内分布实验与显像研究显示,尾静脉注射标记物后,0.5 h荷瘤裸鼠肿瘤部位开始出现放射性浓聚,1 h浓聚更为明显,肿瘤放射性摄取为（1.846±0.511）%ID/g,肿瘤/对侧肌肉组织比值达（2.43±0.30）,此外,肝脏、小肠、肾脏及膀胱等部位也可见明显的放射性浓聚;但3 h后肿瘤部位的放射性浓聚影基本消退。6.肿瘤组织转染截断KDR后,SPECT显像示标记物在肿瘤部位的浓聚明显增强,放射性摄取由（1.98±0.38）%ID/g提高到（3.08±0.84）%ID/g,肿瘤/肌肉比值则由（2.53±0.33）提高到（3.61±0.59）。结论1.本研究成功实现了188Re对QKRKRKKSRYKS的标记,并且获得优化的标记条件,标记物具有良好的体外稳定性和生物结合活性。2.188Re-MAG3-QKRKRKKSRYKS经KDR介导靶向聚集于荷瘤裸鼠的肿瘤组织;肿瘤组织转染截短KDR基因可以明显增强标记多肽在肿瘤组织的聚积量,提高标记物的肿瘤/肌肉比值。3.本课题为进一步开展以KDR为靶点的放射核素内照射治疗实验研究奠定了理论基础。