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【目的】
1.明确白藜芦醇(RSV)对人黑色素瘤A375细胞是否存在增殖抑制作用。
2.控制RSV的浓度与作用时间，比较RSV对人黑色素瘤A375细胞增殖抑制作用是否随着浓度(0、10、50、100μM)梯度与时间梯度(0、6、12、24、48 h)变化而发生变化，探索其中规律。
3.探讨RSV抑制人黑色素瘤A375细胞增殖的相关作用机制。
【方法】
1.细胞分组：用(0、10、50、100μM)浓度的RSV分别处理人黑色素瘤A375细胞6、12、24、48和72h。通过CCK-8法检测各组A375细胞的增殖抑制率；流式细胞仪对各组经相应处理后的细胞凋亡、细胞形态和细胞周期进行测定。
2.Westernblot分别检测各组人黑色素瘤A375细胞中具有调整细胞周期作用的CyclinD1、Rac1和PCDH9蛋白表达水平。
【结果】
1.CCK-8检测结果：RSV对A375细胞增殖的抑制作用与RSV作用的时间和RSV的浓度相关的。随着作用时间和RSV浓度的增加，增殖抑制作用愈大。经处理后6，12和24h，RSV对A375细胞活力抑制作用上升趋势明显；而从24、48和72h起，抑制作用的增长较前平缓，并且在不同浓度(0、10、50、100μM)下，RSV对A375细胞抑制作用的增加趋势相似。另外结果表明，处理时间对细胞活力的影响尤为重要。随着RSV作用时间的增加，半最大抑制浓度(IC50)明显降低。例如，测得在第6h时100μM的RSV处理下对A375细胞活性的抑制率仅为21.92%；12h后，IC50约为100μM；而在24h，IC50小于50μM。最后作用时间达48h和72h，IC50更接近于10μM。
2.RSV对A375细胞凋亡的调控：结果表明，RSV对A375细胞的抑制作用随作用时间和浓度的变化而变化，例如RSV浓度越高，作用时间越长，A375细胞活性越低并出现更多的死细胞。另外A375细胞的凋亡率与RSV处理时间和浓度有关：即随着RSV处理时间的延长和浓度的升高，更多的A375细胞发生早期凋亡。
3.RSV对A375细胞的细胞周期调控：在50和100μM的RSV浓度处理24h后，可诱导大多数细胞周期阻滞在G1检查点(50μM-73.66%和100μM-78.03%)；进入G2期的细胞中，各组(10、50、100μM)并没有很大区别(5.89%, 5.58%、4.35%)。但随着RSV处理的时间延长，阻滞在G1期的A375细胞反而较前减少。经48h处理，G1期细胞在10、50、100μM分别占41.05%、18.89%和31.21%，而72h后各组G1期细胞分别占68.47%、49.56%和36.57%。即使在浓度较高的48h和72h时，阻滞在G1期的细胞百分比较24h低，考虑是在24h后，在较高浓度RSV的作用下，肿瘤细胞发生凋亡而坏死。因此RSV作用的G1期阻滞是与作用时间相关的。
4.Westernblot分别检测可调节细胞周期的CyclinD1、Rac1和PCDH9蛋白表达水平：发现RSV处理时间对CyclinD1和PCDH9的表达有显著影响，差异有统计学意义(p＜0.05)，而RSV浓度的影响不如处理时间。但处理时间和RSV浓度对Rac1的表达均无明显影响。根据柱状图结果表明，RSV在大部分处理时间(6、24和48h，除12h外)均下调了CyclinD1和PCDH9蛋白的表达，而Rac1的表达无明显规律性。
【结论】
1.RSV具有抑制人黑色素瘤A375细胞增殖的作用，该抑制作用随着作用时间和浓度的增加而增加。
2.RSV可能通过影响细胞周期的进程抑制A375细胞增殖，并诱导细胞凋亡；且RSV的处理时间比其浓度起着更重要的作用。
3.RSV可能通过可调控细胞周期的蛋白(Cyclin D1、PCDH9)的表达来调控A375的细胞周期进程，达到抑制A375细胞的增殖并促进其凋亡。
1.明确白藜芦醇(RSV)对人黑色素瘤A375细胞是否存在增殖抑制作用。
2.控制RSV的浓度与作用时间，比较RSV对人黑色素瘤A375细胞增殖抑制作用是否随着浓度(0、10、50、100μM)梯度与时间梯度(0、6、12、24、48 h)变化而发生变化，探索其中规律。
3.探讨RSV抑制人黑色素瘤A375细胞增殖的相关作用机制。
【方法】
1.细胞分组：用(0、10、50、100μM)浓度的RSV分别处理人黑色素瘤A375细胞6、12、24、48和72h。通过CCK-8法检测各组A375细胞的增殖抑制率；流式细胞仪对各组经相应处理后的细胞凋亡、细胞形态和细胞周期进行测定。
2.Westernblot分别检测各组人黑色素瘤A375细胞中具有调整细胞周期作用的CyclinD1、Rac1和PCDH9蛋白表达水平。
【结果】
1.CCK-8检测结果：RSV对A375细胞增殖的抑制作用与RSV作用的时间和RSV的浓度相关的。随着作用时间和RSV浓度的增加，增殖抑制作用愈大。经处理后6，12和24h，RSV对A375细胞活力抑制作用上升趋势明显；而从24、48和72h起，抑制作用的增长较前平缓，并且在不同浓度(0、10、50、100μM)下，RSV对A375细胞抑制作用的增加趋势相似。另外结果表明，处理时间对细胞活力的影响尤为重要。随着RSV作用时间的增加，半最大抑制浓度(IC50)明显降低。例如，测得在第6h时100μM的RSV处理下对A375细胞活性的抑制率仅为21.92%；12h后，IC50约为100μM；而在24h，IC50小于50μM。最后作用时间达48h和72h，IC50更接近于10μM。
2.RSV对A375细胞凋亡的调控：结果表明，RSV对A375细胞的抑制作用随作用时间和浓度的变化而变化，例如RSV浓度越高，作用时间越长，A375细胞活性越低并出现更多的死细胞。另外A375细胞的凋亡率与RSV处理时间和浓度有关：即随着RSV处理时间的延长和浓度的升高，更多的A375细胞发生早期凋亡。
3.RSV对A375细胞的细胞周期调控：在50和100μM的RSV浓度处理24h后，可诱导大多数细胞周期阻滞在G1检查点(50μM-73.66%和100μM-78.03%)；进入G2期的细胞中，各组(10、50、100μM)并没有很大区别(5.89%, 5.58%、4.35%)。但随着RSV处理的时间延长，阻滞在G1期的A375细胞反而较前减少。经48h处理，G1期细胞在10、50、100μM分别占41.05%、18.89%和31.21%，而72h后各组G1期细胞分别占68.47%、49.56%和36.57%。即使在浓度较高的48h和72h时，阻滞在G1期的细胞百分比较24h低，考虑是在24h后，在较高浓度RSV的作用下，肿瘤细胞发生凋亡而坏死。因此RSV作用的G1期阻滞是与作用时间相关的。
4.Westernblot分别检测可调节细胞周期的CyclinD1、Rac1和PCDH9蛋白表达水平：发现RSV处理时间对CyclinD1和PCDH9的表达有显著影响，差异有统计学意义(p＜0.05)，而RSV浓度的影响不如处理时间。但处理时间和RSV浓度对Rac1的表达均无明显影响。根据柱状图结果表明，RSV在大部分处理时间(6、24和48h，除12h外)均下调了CyclinD1和PCDH9蛋白的表达，而Rac1的表达无明显规律性。
【结论】
1.RSV具有抑制人黑色素瘤A375细胞增殖的作用，该抑制作用随着作用时间和浓度的增加而增加。
2.RSV可能通过影响细胞周期的进程抑制A375细胞增殖，并诱导细胞凋亡；且RSV的处理时间比其浓度起着更重要的作用。
3.RSV可能通过可调控细胞周期的蛋白(Cyclin D1、PCDH9)的表达来调控A375的细胞周期进程，达到抑制A375细胞的增殖并促进其凋亡。