目的:　　本研究通过生物信息学方法整合神经胶质瘤拷贝数变化与基因表达谱数据，筛选出可能影响神经胶质瘤发生发展的关键基因(Gli2)，并以转录因子Gli2对神经胶质瘤下游靶基因的调控为重点，明确受转录因子Gli2调控的miRNAs，深入研究异常活化的Hh信号通路促进神经胶质细胞瘤恶性增殖的分子机制，试图发现新的分子靶标，为神经胶质瘤诊疗新靶点的选择提供理论依据。　　第一部分:整合分析神经胶质瘤基因表达变化　　方法:　　1、为了发掘可能与神经胶质瘤发生发展密切相关的基因，我们通过NCBIGEO数据库检索神经胶质瘤cGH芯片数据，通过CGH Analytics4.0软件进行深度分析，以期筛选出神经胶质瘤发生发展过程中的拷贝数变化。　　2、通过NCBI GEO数据库检索神经胶质瘤表达谱芯片数据集，进行差异表达基因的meta分析，通过合并effect size以及p-value的基因芯片meta分析的方法明确不同级别胶质瘤中差异显著的基因，再将meta结果与拷贝数进行交集，以期筛选可能影响神经胶质瘤进展的关键基因。　　结果:　　1、通过对神经胶质瘤eGH芯片数据进行深度分析，我们发现包括107个基因在内的14个染色体区域拷贝数发生改变。　　2、通过基因芯片meta分析，我们发现312个在不同级别神经胶质瘤组织中差异表达的基因，将基因芯片meta分析的结合与拷贝数变化基因取交集后，我们筛选出11个关键基因(MYCN、JAK2、DMRT3、CDKN2C、GLI2、KLF6、TXNL4A、C9ORF53、MET、BRFA、CALMK3)。　　结论:　　通过整合拷贝数变化数据与基因表达谱改变，我们筛选出了11个可能参与影响神经胶质瘤发生发展的基因(MYCN、JAK2、DMRT3、CDKN2C、GLI2、KLF6、TXNL4A、C9ORF53、MET、BRFA、CALMK3)。　　第二部分:转录因子Gli2功能探索　　方法:　　1、为了明确Gli2对神经胶质瘤细胞增殖的影响，我们转染sh-Gli2-228质粒下调神经胶质瘤细胞(H4、U87)Gli2水平，通过平板克隆形成实验检测抑制Gli2表达对神经胶质瘤细胞增殖的影响。为了进一步探讨Gli2对神经质瘤细胞活力的影响，我们在分别转染shRNA control质粒与shRNA-Gli2-228干扰质粒后，同时给予Gli特异性抑制剂GANT61（0μM、5μM、10μM、20μM）处理神经胶质瘤细胞(H4、U87)48h，通过MTT实验检测细胞的活力。　　2、为了探讨Gli2是否影响神经胶质瘤患者的生存，我们通过R2基因芯片分析平台，分析Gli2对神经胶质瘤患者OS、PFS的影响。　　结果:　　1、通过平板克隆实验，我们发现干扰神经胶质瘤细胞系Gli2表达后，细胞克隆形成能力显著下降。通过MTT检测，我们发现，在转染shRNA control质粒组，GANT61可显著抑制神经胶质瘤细胞活力，并呈一定的剂量依赖性，然而在转染了sh-Gli2-228质粒干扰后，GANT61对神经胶质瘤活力抑制的剂量依赖性受到部分影响。　　2、通过R2平台进行生存分析，在多个数据集中，我们发现，Gli2的高表达与预后不良密切相关，Gli2高表达的患者，PFS、OS时间更短。　　结论:　　1、Gli2影响神经胶质瘤细胞增殖。　　2、Gli2高表达与神经胶质瘤患者预后不良密切相关。　　第三部分:转录因子Gli2调控神经胶质瘤细胞miR-124表达　　方法:　　1、为了研究Gli2是否参与调控神经胶质瘤细胞miRNA的表达，我们首先采用Gli特异性抑制剂GANT61(20μM，48h)阻断H4细胞Hh信号通路，通过miRNA表达谱芯片检测miRNA表达变化，并通过Real-time PCR方法对筛选出的差异表达基因进行验证。　　2、miRNA的表达受多种方式调控，为了探讨Gli2是否在转录水平影响miR-124表达，我们采用RNAi技术干扰Gli2表达，通过Real-time PCR检测pri-miR-124、pre-miR-124与mature-miR-124的表达。　　3、为了进一步研究Gli2是否影响miR-124的转录，我们通过生物信息学在线分析预测在miR-124的转录起始位点上游区域是否存在潜在的Gli2结合位点，并通过ChIP实验检测Gli2是否与预测位点相结合。　　结果:　　1、采用GANT61抑制Hh信号通路后，通过miRNA表达谱芯片检测，我们发现34个miRNA的表达发生改变。通过Real-time PCR对芯片筛选出的差异表达miRNA进行验证，结果发现，miR-124，miR-302d，miR-519a，miR-335和miR-122表达变化情况与芯片结果一致。　　2、采用RNAi技术干扰Gli2表达后，通过Real-time PCR检测发现，神经胶质瘤细胞pre-miR-124，pri-miR-124，mature miR-124表达增加。　　3、通过生物信息学在线分析预测在miR-124的转录起始位点上游区域存在7个转录因子Gli2的潜在结合位点(BS1:-9789～-9798，BS2:-9255～-9234，BS3:-6235～-6244,BS4:-6034～-6025,BS5:-5547～-5538,BS6:-2944～-2935,and BS7:-560～-551)。ChIP实验证实Gli2与miR-124的转录起始位点上游序列(BS2:-9255AGGCTGGTTTCAAACTCCTG-9234)相结合。　　结论:　　1、Gli2导致神经胶质瘤细胞miRNA表达谱发生改变。　　2、Gli2通过与miR-124转录起始位点上游序列结合，在转录水平调控miR-124表达。　　第四部分:miR-124靶向调控神经胶质瘤细胞AURKA表达　　方法:　　1、我们通过生物信息学预测miR-124的下游靶基因。　　2、为了明确miR-124是否调控AURKA表达，我们分别上调/下调miR-124表达，通过Real-time PCR和western blot检测上调/下调miR-124对神经胶质瘤细胞AURKA表达的影响。　　3、为了进一步明确miR-124是否通过与AURKA3-UTR结合，直接靶向调控AURKA分子，我们通过luciferase实验检测miR-124对AURKA3-UTR(wt)以及AURKA3-UTR(mut)荧光素酶报告基因活性的影响。　　结果:　　1、通过生物信息学预测，我们发现，AURKA是miR-124的潜在靶基因。　　2、过表达miR-124后，神经胶质细胞AURKA mRNA与AURKA蛋白表达下降;反之，干扰miR-124表达后，神经胶质瘤细胞AURKA mRNA与AURKA蛋白表达增加。　　3、Luciferase检测发现，miR-124通过与AURKA3-UTR区结合，影响神经胶质瘤细胞AURKA表达。　　结论:　　1、miR-124负性调控神经胶质瘤细胞AURKA表达。　　2、miR-124通过与AURKA mRNA3-UTR结合而发挥抑制AURKA表达的功能。　　第五部分:Gli2/miR-124/AURKA信号轴影响神经胶质瘤细胞增殖　　方法:　　1、我们之前的研究发现，通过GANT61阻断Hh信号通路后，H4细胞基因表达谱发生改变，其中AURKA表达下降，然而对其启动子区进行分析并未发现潜在的Gli2结合位点。我们在本项目前一部分的研究已经证实Gli2调控miR-124表达，且miR-124靶向调控AURKA分子，为了探讨Gli2是否通过miR-124影响AURKA表达，我们在给予GANT61阻断Hh信号通路的同时，干扰miR-124，通过western blot和Real-time PCR分别检测AURKA蛋白和mRNA水平。　　2、为了进一步明确Gli2是否通过miR-124调控AURKA，我们在转染Gli2干扰质粒的同时下调miR-124水平，通过western blot和Real-time PCR分别检测AURKA蛋白和mRNA变化。　　结果:　　1、通过western blot与Real-time PCR检测，我们发现，采用GANT61抑制神经胶质瘤细胞Hh信号通路后，AURKA表达下降，而在抑制Hh信号的同时联合干扰miR-124，AURKA表达有所增加。　　2、通过western blot与Real-time PCR检测发现，与转染空载组相比，转染Gli2干扰质粒可显著下调神经胶质瘤细胞AURKA水平，然而在Gli2干扰的同时联合抑制miR-124作用，AURKA蛋白表达减少的趋势可被部分恢复。　　结论:　　1、Gli2通过miR-124调控神经胶质瘤细胞AURKA表达。　　2、Gli2/miR-124/AURKA信号轴影响神经胶质瘤细胞增殖。