目的:大肠癌是常见的消化道恶性肿瘤之一。到目前为止,大肠癌的病因及发病机制仍不明确,既往研究认为多种因素参与了大肠癌的发生发展,包括饮食结构、肥胖、运动以及个人的遗传因素等。近年来的研究发现肠道微生态及其代谢模式的改变可能在大肠癌的发生发展过程中发挥重要的作用。近来,肠道微生态改变引起肠癌发生发展已引起高度重视,而且已不断有文献报道具核梭杆菌在其中的作用。本研究正是基于我国人群特征,探索大肠癌患者的肠道菌群特征性改变,在肠道中寻找类似幽门螺杆菌的特异性致癌细菌并探讨其与大肠癌预后的相关性。方法:(1)临床样品的收集。新鲜大肠癌(35例)及癌旁正常粘膜样品(19例)、炎性肠病(包括克隆病和溃疡型结肠炎,共20例)粘膜样品及大肠腺瘤样品(15例)来自上海交通大学附属第六人民医院消化内镜中心2011年9月至2012年9月的患者,经病理组织学证实,大肠癌患者需进一步手术治疗。内镜检查1周(肠道菌群结构基本恢复正常)后收集患者的粪便样品;同时22例大肠癌患者分为两组,术前分别口服益生菌制剂(培菲康散剂)和安慰剂一周,术中收集大肠癌粘膜样品和癌旁正常粘膜样品,术后一周收集粪便样品。此外,15例健康志愿者正常肠黏膜样品和粪便样品由上海市闸北区社区居民提供。所有样品均符合相应的纳入排除标准,并经上海交通大学附属第六人民医院伦理委员会批准。所有患者和健康志愿者均签署志愿者知情同意书。(2)大肠癌患者肠道菌群结构改变的检测。利用QIAamp DNA试剂盒对标本进行基因组DNA抽提;利用1%琼脂糖凝胶电泳检测抽提的基因组DNA,对各标本基因组DNA含量进行鉴定;利用ABI GeneAmp对抽提的基因组DNA进行PCR扩增,并用2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物、继而荧光定量;利用Roche GS FLX454测序仪对PCR扩增产物的16S rRNA V3可变区进行焦磷酸测序,通过SILVA数据库将所测序列进行序列比对,并经good’s覆盖率、多样性指数、pca、lefse判别分析等多种方法对各组微生物种类进行分类学和多样性的比较,以期发现大肠癌患者肠道菌群结构的差异性改变。(3)具核梭杆菌(fusobacteriumnucleatum,fn)和莓实假单胞菌(pseudomonasfragi,pf)的临床验证。选择2007年1月至2011年12月同济大学附属第十人民医院283例行手术切除的大肠癌石蜡标本。其中,男性患者144例,女性139例,年龄40-80岁,平均年龄67岁。首先进行qrt-pcr检测,利用mirneasyffpekit(qiagen,217504)试剂盒对上述石蜡样品脱蜡,并对组织样品的总rna进行抽提;用逆转录酶reversetranscriptasem-mlv(d2640a,takara)进行逆转录合成cdna;并设计和合成fn和pf菌的引物,最后通过realtimepcr仪进行扩增和定量。我们采用免疫荧光原位杂交技术(fluorescenceinsituhybridization,fish)对大肠癌粘膜表面的fn和pf菌进行定位检测。(4)fn及pf表达水平与大肠癌预后的相关性分析。采用癌粘膜∶癌旁正常粘膜比值的50百分位数作为分界点,即将比值高于分界点的病例归入高fn表达组,而将比值低于分界点的病例归入低fn表达组。同样将比值高于分界点的病例归入高pf表达组,而将比值低于分界点的病例归入低pf表达组。将pf作为分层指标对fn分层并进一步分析。采用kaplan-meier法及logrank检验进行生存分析。采用cox比例风险模型进行大肠癌生存的单因素和多因素分析。(5)益生菌干预对大肠癌患者肠道菌群结构的影响。利用qiaampdnamini试剂盒对上述益生菌干预标本进行基因组dna抽提,后续基因组dna鉴定、pcr扩增、荧光定量、16srrnav3可变区测序和生物信息学分析方法同前;分组比较大肠癌组与益生菌干预组粘膜表面菌群结构的差异并探讨益生菌干预大肠癌肠道菌群的可行性。结果:(1)焦磷酸测序研究结果表明,大肠癌患者的肠道菌群整体结构与健康对照人群相比具有显著的差异。从门的水平来看,与正常人相比,大肠癌患者粘膜相关菌群中厚壁菌门(firmicutes)和梭杆菌门(fusobacteria)丰度显著增加,而变形菌门(proteobacteria)丰度明显下降;虽然拟杆菌门(bacteroidetes)和放线菌门(actinobacteria)在肿瘤组中丰度较高,但两组间无显著性差异;在属水平上,大肠癌病人中lactococcus(50.85%vs.25.35%,p=0.007),fusobacterium(10.08%vs.0.01%,p=0.032),escherichia–shigella(2.92%vs.0.22%,p=0.004)丰度明显高于健康人群,而flavobacterium,pedobacter,sphingobacterium,cau-lobacter,brevundimonas,sphingomonas,sphingomonas,acidovorax,buttiauxella,rahnella,acinetobacter,psychrobacter,pseudomonas,stenotro-phomonas,psychrobacter丰度则明显降低。采用判别分析结合效应大小模型(lefse),发现fusobacterium,prevotella及bacteroides构成大肠癌患者肠粘膜的“核心菌群”,而pseudomonas和flavobacterium则构成健康人群的“核心菌群”。粪便样品具有与粘膜组织完全不同的菌群结构,主要表现在大肠癌患者的粪便firmicutes菌和bacteroidetes菌丰度明显降低,而proteobacteria和actinobacteria丰度则明显升高,fusobacteria在两组中丰度都较低,差异没有显著性。对大肠癌患者的癌组织、癌旁组织及粪便样品三者间的菌群结构进行了比较,发现它们之间也存在明显差异,bacteroidetes在癌旁粘膜上丰度最高,proteobacteria在粪便样品中丰度最高,fusobacteria则在肿瘤粘膜上丰度最高,firmicutes在三者间的丰度逐渐降低,但差异没有显著性。本研究结果表明,正常人肠道内存在两个“核心菌群”,一个位于大肠粘膜,即粘膜相关“核心菌群”,可能主要通过与肠上皮直接接触发挥作用;另一个位于肠腔内,即“肠腔相关核心菌群”,可能主要通过代谢调节肠道功能。正常情况下,这两个“核心菌群”对维持健康的肠道功能发挥重要的作用,而“核心菌群”结构的偏移与大肠癌的发生关系密切。(2)本研究对大肠癌差异菌fusobacterium和pseudomonas两种菌与细菌库进行比对,从种的水平筛选出的差异菌分别为fusobacteriumnuclea-tum(fn)和pseudomonasfragi(pf)。qrt-pcr结果显示fn在大肠癌粘膜表面富集,而pf则丰度明显降低,与前期的实验结果一致;其次,fish结果证实部分fn可侵入粘膜固有层,提示fn可能参与大肠癌的发生发展过程。(3)单因素和多因素预后分析结果显fn表达情况是影响结肠癌患者生存的独立预后因素(hr=1.71,p=0.039),而pf表达水平与大肠癌预后关系不明显,但以pf作为分层指标对fn进一步分层后发现fn对预后的影响更大,说明fn和pf的表达情况可以作为一个有价值的分子标记物。(4)益生菌干预研究结果显示,口服益生菌能明显改善大肠癌患者肠道菌群结构,并特异性降低具有潜在治病性的Fn菌丰度,初步显示出对大肠癌患者肠道菌群结构的调整能力。结论:大肠癌患者肠道菌群结构发生特征性改变,主要表现在核心菌群结构的改变,以Fn和Pf为代表的核心菌群可能参与了大肠癌的发生发展过程;同时,Fn在肿瘤局部的表达情况与大肠癌患者预后密切相关,Fn高表达伴随Pf的高表达预示着预后较差的;此外,益生菌干预能明显改变大肠癌患者肠道菌群结构,降低Fn丰度。提示Fn及Pf可作为大肠癌风险筛查、治疗策略和预后预测的一个潜在性指标。此外,通过肠道益生菌干预可作为预防和治疗大肠癌的一个可行性方案。