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[背景]病毒性心肌炎(viral myocarditis,VMC)是由病毒感染引起的以心肌细胞变性坏死和间质局灶/弥散性炎症细胞浸润为特征的常见心血管疾病,发病隐秘,缺乏临床诊断和治疗手段,近年发病不断增高,VMC慢性化与致死性心衰、扩张性心肌病发病密切相关。以柯萨奇病毒(Coxsackievirus)为主的肠道病毒感染是发展中国家VMC的主要诱因。其中,柯萨奇病毒B3(Coxsackievirus B3,CVB3)与扩心病、心衰发生最为相关。CVB3性VMC的发病与初始病毒直接损伤心肌和后续宿主免疫炎性损伤相关。早期研究认为CVB3诱导心肌细胞凋亡是VMC发病的重要原因。目前将细胞死亡细分为凋亡(Apoptosis)、焦亡(Pyroptosis)、自噬(Autophagy)、坏死(Necrosis)和程序性坏死(Necroptosis)等。CVB3究竟诱导心肌细胞发生怎样的死亡尚未完全阐明。[目的]本研究在CVB3诱导的VMC模型中,研究了 CVB3感染早期心肌细胞死亡的确切类型及其在VMC发病中的作用及其对病毒复制的影响和机制。[方法]1、CVB3感染小鼠诱导VMC模型:1500 TCID50剂量CVB3腹腔感染4周龄雄性BALB/c小鼠,小鼠7天死亡率为20-40%、体重减轻20%、病毒复制在第3天达峰值、心脏呈现心肌细胞坏死和大量炎症浸润。2、H&E染色:心脏等组织经过甲醛固定、脱水、包埋、切5μm切片,进行H&E染色。3、病毒滴度检测:组织30 mg,0.5ml PBS匀浆,离心取上清,按10-1-10-10进行梯度稀释,取100 μl感染Hela细胞,连续观察5-7天,然后按照Reed-Muench方法计算病毒的TCID50。4、ELISA检测小鼠心脏匀浆液:心脏制备匀浆液ELISA试剂盒检测TNF-α、IL-1β、IL-6、MCP-1 蛋白水平。5、RT-PCR:用Trizol试剂提取总RNA,按逆转录Prime Script TM试剂盒合成cDNA,使用Takarat试剂盒进行RT-PCR。6、流式细胞术:分离感染0、3、7天外周血单核细胞,流式检测小鼠髓系(CD45+CD11b+)、中性粒细胞(CD11b+Ly6G+)比例。[结果]1、CVB3感染早期,心脏组织发生优势性高水平的程序性坏死和低水平的凋亡,以第7天为高峰:Western Blot、RT-PCR和IHC检测CVB3感染0~7天心脏组织的死亡标志物,发现:1)随时间逐步增高,CVB3诱导了心脏组织发生低水平焦亡(Caspase1)和凋亡(Caspase3);3)CVB3诱导了较为显著的程序性坏死(RIPK3),第3天显著上调,第7天达峰值。2、CVB3诱导心肌细胞而非心肌成纤维细胞发生了程序性坏死:Western Blot和RT-PCR检测CVB3感染乳鼠原代心肌细胞和心肌成纤维细胞,发现感染6-48 hr心肌细胞RIPK3表达显著上调;而心肌成纤维细胞RIPK3未升高。3、CVB3诱导小鼠骨髓来源中性粒细胞发生程序性坏死:CVB3刺激骨髓来源中性粒细胞3 hr,也诱导程序性坏死,3天心脏匀浆上清(含DAMP)刺激效果最佳。4、程序性坏死被抑制后显著促进了 CVB3诱导的VMC:CVB3感染4 hr后,每天腹腔注射抑制剂Nec-1(0.6 mg/kg)共7次,与PBS与DMSO对照相比,发现:1)Nec-1显著抑制了 0-7天心肌程序性坏死;2)Nec-1组小鼠14天死亡率显著低于对照(20%vs.40%-60%,p<0.01),体重下降稍低于对照。3)7、14天小鼠心脏HE染色证实:Nec-1组心肌细胞坏死和免疫细胞浸润较对照组明显减轻。4)Nec-1组0、3、7天心脏匀浆液TNF-α、IL-1β、IL-6、MCP-1水平显著降低。5)流式细胞术发现:Nec-1组外周血CD11b+髓系细胞(day3,54.7%vs.71.4%,p<0.01;day7,37.9%vs.49.9%,p<0.01)和 CD11b+Ly6G+中性粒细胞(86.7%vs 94.1%,p<0.01;day7,76.5%vs.85%,p<0.01)比例显著降低。6)心超动态成像检测发现:第7天,Nec-1组VMC小鼠心脏舒张功能显著改善,LVIDd和LVIDs值明显降低,左室射血分数(EF%)和左室短轴缩短率(FS%)值显著增高。5、程序性坏死促进CVB3诱导的胰腺炎发生:CVB3感染小鼠胰腺上调RIPK3表达,提示发生程序性坏死。注射抑制剂Nec-1后小鼠第7天胰腺组织炎症浸润明显减轻。6、程序性坏死显著促进CVB3病毒复制:1)Nec-1组3、7天心脏病毒蛋白VP1显著减少(减少70-90%)。2)CVB3的正、负链RNA水平显著降低。3)TCID50检测发现Nec-1组心脏匀浆病毒滴度显著降低(降低了 33%-56%)。4)流式细胞术发现:Nec-1组小鼠第3天外周血CD3+T(83.6 vs.86.9,p<0.01)、CD8+T(12.4%vs.9%,p<0.01)比例较PBS对照显著增高。5)CVB3感染原代心肌细胞1hr后加入Nec-1,发现显著抑制6、12、24、48 hr的病毒VP1蛋白水平。6)胰腺组织VP1蛋白水平显著减少。提示程序性坏死促进CVB3病毒在心脏和胰腺的复制及对CD8+T细胞的裂解。7、程序性坏死通过抑制心脏局部I型干扰素生成促进病毒复制:1)发现Nec-1组小鼠3天心脏、外周血中IFN-β/α表达显著升高。2)CVB3感染原代心肌细胞和心肌成纤维细胞1 hr后加Nec-1,发现IFN-β通路上游元件TRIF、TBK1、p-IRF3和下游干扰素诱导基因ISG15和ISG54均显著上调表达。综上,本课题在CVB3诱导的VMC模型中,证实程序性坏死是CVB3感染心脏组织及心肌细胞诱导的主要死亡方式;我们首次发现程序性坏死通过促进心脏和胰腺病毒复制促进急性病毒性心肌炎和病毒性胰腺炎发生。提示了将程序性坏死作为靶点的VMC治疗新策略。