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肝脏是动物体内重要的代谢和解毒器官,其结构和功能的完整是保证生命活动顺利进行的关键,肝细胞凋亡由于和肝脏损伤或疾病关系密切而逐渐受到人们的关注。同时,肝脏又像一个化学工厂,脂类的分解代谢和合成代谢、消化、吸收、运输都与肝脏有着密切的关系。SOCS3(Suppressor of cytokine signaling3)作为一种细胞细胞因子信号转导抑制分子,在细胞增殖、分化、凋亡等多种生命活动中发挥重要作用。本试验以健康昆白小鼠为研究对象,将重组质粒pEGFP-N1-SOCS3溶于林格氏液中,经尾静脉高压注射将大剂量的混合溶液短时间内注射进小鼠体内,在注射后12h、24h、48h三个时间点杀死小鼠进行眼眶采血,用于血脂的测定。取肝脏、肾、腿肌等组织,一部分-80℃保存,用于总RNA和总蛋白的提取,一部分置于4%多聚甲醛溶液中进行固定,用于冷冻切片的制作。试验中通过Hoechst染色、TUNEL染色进行肝细胞凋亡的观察,主要测定小鼠体重、血清中甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白(HDL-C)以及低密度脂蛋白(LDL-C)浓度的变化,同时利用Real-time PCR检测SOCS3、凋亡相关基因Bax、Bcl-2、Caspase-3、c-myc和Mcl-1、脂代谢关键酶基因HSL、ATGL和FAS的mRNA表达水平变化,Western blotting检测凋亡相关基因Bax、Bcl-2及Caspase-3、JAK2/STAT3信号通路关键基因、脂代谢关键酶基因HSL、ATGL和FAS的蛋白水平变化,探讨在小鼠体内超表达SOCS3对肝细胞凋亡及脂质代谢的影响作用。主要研究结果如下：1.重组质粒pEGFP-N1-SOCS3经尾静脉高压注射入小鼠体内后,肝脏组织冷冻切片在荧光显微镜下观察发现,12h处理组即有明显的GFP表达,24h处理组的GFP表达有所增强,而在48h处理组就有所下降,证明转染成功。RT-PCR检测SOCS3的mRNA表达,与正常对照组相比,在肝脏、肾脏、腿肌中SOCS3的mRNA表达都有所增加,但在肝脏中表达的增加最显著(P<0.01)。2.重组质粒pEGFP-N1-SOCS3经尾静脉高压注射入小鼠体内后,小鼠肝脏组织冷冻切片的HE染色发现,注射12h后肝小叶中央静脉及四周的肝窦扩张,肝窦内有明显淤血,未发现明显的坏死灶：注射24h后,肝窦间隙增宽,肝窦内淤血已消退,肝细胞结构正常；注射48h后基本恢复正常。Hoechst33258和TUNEL染色后,各组均存在正常细胞与凋亡细胞,重组质粒处理组的凋亡细胞数量明显增多,并且随着时间的延长,凋亡的细胞数目有增多的趋势。3.重组质粒pEGFP-N1-SOCS3经尾静脉高压注射入小鼠体内后,与常对照组相比,在重组质粒处理组中,Bax基因的mRNA表达在12h处理组显著升高(P<0.01),随后逐渐降低；c-myc基因的mRNA表达在重组质粒处理逐渐升高,在转染24h后达到显著水平(P<0.05)；Bcl-2基因的mRNA表达则在12h处理组显著降低(P<0.05),24h处理组则是达到了极显著的降低(P<0.01),往48h处理组则是有所恢复,但仍显著低于正常对照组(P<0.05)。Western blotting检测发现,Bax蛋白水平正在12h处理组也是极显著上升(P<0.01),随后逐渐降低；Bcl-2蛋白水平则足在12h处理组显著降低(P<0.05)；Caspase-3蛋白水平在12h处理组即出现明显升高,达到极显著水平(P<0.01),随后迅速降低,甚至低于正常对照组,但未达到显著水平：同时,空质粒转染时,Bax、Bcl-2、Caspase-3三种蛋白的表达水平都与常对照组比没有显著蔗异。而重组质粒处理组中p-STAT3蛋白水平在12h时显著降低(P<0.05),24h、48h又逐渐升高,但仍低于正常对照组(P>0.05),空质粒处理组中p-STAT3蛋白水平没有显著变化(P>0.05)。由此推断,体内转染重组质粒pEGFP-N1-SOCS3可能通过调控JAK2/STAT3信号通路关键基因及凋亡相关基因的表达来促进小鼠肝细胞凋亡。4.小鼠经尾静脉高压注射重组质粒pEGFP-N1-SOCS3后,在12h、24h、48h、三小时间点杀死小鼠解剖后发现,与对照组相比,注射12h、24h后,小鼠腹部脂肪没有显著变化,注射48h后有较为明显的增加。小鼠血清中的TG、TC和LDL-C的浓度随着时间延长逐渐升高,在48h处理组中升高达到显著水平(P<0.05)；而HDL-C浓度有降低趋势,但不显著。RT-PCR检测发现,HSL和ATGL的mRNA农达都有显著降低,其中HSL是在24h处理组中达到显著水平(p<0.05), ATGL则是在48h处理组中有显著降低(p<0.05)：而FAS的mRNA表达在24h和48h处理中都有显著升高(p<0.05)。Western blotting检测显示,与空白对照组相比, FAS的蛋白表达显著下降,其中12h、24h处理组达到显著水平(p<0.05); ATGL的蛋白表达则显著上升,其中12h、24h处理组达到显著水、平(p<0.05)。Western Blotting检测与Real-time PCR结果基本一致。此外,PPAR-γ和SREBP1的蛋白表达都有所升高,其中在12h和24h处理组二者的表达都有显著升高(p<0.05和p<0.05)。这些结果提示体内转染SOCS3可能通过调控转录因子PPAR-y和SREBP1对脂代谢关键酶基因的表达产生影响,进而对肝细胞脂合成具有促进作用。综上所述,本研究通过尾静脉高压注射实现了SOCS3基因在小鼠个肝脏的超表达。小鼠尾静脉注射重组质粒pEGFP-N1-SOCS3,显著抑制了JAK2/STAT3信号通路的激活,进而促进了小鼠肝细胞的凋亡；上调脂代谢调节因子子PPAR-γ和SREBP1的表达,进而促进了小鼠肝脏脂肪合成作用。