论文部分内容阅读
多糖(polysacharide)是自然界中含量最为丰富的生物聚合物,是由单糖聚合而成的天然高分子化合物,它们是维持生命机体运转正常的基本物质之一,其多样性的生物功效包括有结构支持、能量储存、防御以及抗原定性等。本文以车前子为对象,经碱提醇沉提取,透析,阴离子交换和凝胶过滤色谱技术,得一种均一车前子多糖(PLP)。本文研究了 PLP免疫活性及其作用机制。实验结果表明PLP能够促进小鼠B淋巴细胞增殖但不能引起T淋巴细胞的增殖;此外,PLP还能增强小鼠巨噬细胞RAW264.7的吞噬作用和NO释放水平。在此基础上,以巨噬细胞RW264.7为研究对象进行多糖的作用机制研究。荧光标记PLP与巨噬细胞孵育,发现PLP可以直接与巨噬细胞结合;用小鼠封闭抗体anti-TLR2和anti-TLR4使巨噬细胞中Toll样受体TLR2和TLR4失活后,发现PLP对巨噬细胞的亲和力及其介导的细胞增殖水平呈显著下降趋势,说明PLP介导的巨噬细胞活化需要TLR2和TLR4的参与;用亲和吸附沉淀对PLP与TLR2、TLR4的相互作用进行确证,采用1-氰基-4-二甲胺吡啶四氟硼酸盐(CDAP)活化法偶联PLP与氨基预活化凝胶EAHSepharose4B制备亲和基质,利用制备得的PLP亲和基质与破碎后的巨噬细胞细胞膜PLP结合蛋白进行吸附沉淀,Western Blot在沉淀成分中可以检测到TLR2和TLR4的存在,从而确证了 PLP与TLR2、TLR4的相互作用;免疫印迹法进一步对TLR2、TLR4下游关键的信号分子—丝裂原蛋白活化激酶(MAPK)在PLP介导的巨噬细胞活化过程中的作用效果进行相关研究,结果表明PLP可以有效引起MAPK三个亚族(p38MAPK、ERK、JNK)的磷酸化,上述通路的特异性抑制剂可以不同程度地抑制PLP的活化能力,根据抑制率的大小,ERK参与PLP介导的巨噬细胞增殖能力最强。