关于未成熟DCs表面表达的LIGHT是否可以直接向未成熟DCs传递信号,影响未成熟DCs功能,目前国内外也未见报道。然而用可溶性受体蛋白作用于DCs,模拟T细胞与DCs之间的信号通路,研究相应共刺激通路的反向信号的文章,已见报道。例如,用可溶性CTLA-4-Ig模拟T细胞表面的CTLA-4,作用于DCs表达的B7-1/B7-2,发现CTLA-4-Ig可以刺激DCs产生IFN-γ；后者通过诱导吲哚胺2、3过氧化酶(IDO)活性增强,大量分解T细胞增殖分化所必须的氨基酸——色氨酸,从而抑制活化T细胞的增殖；该效应在维持母体和胎儿之间的免疫耐受、抑制T细胞对肿瘤、自身抗原及MHC不相容移植物的反应具有重要作用。此外,表达在B细胞上的B7-2也可传递逆向信号给B细胞,刺激B细胞产生IgG1和IgE;这种作用对于B7-2高表达的记忆B细胞特别重要。说明,B7分子不仅可通过CD28/CTLA-4正向传递共刺激信号或共抑制信号给T淋巴细胞,还可以逆向传递信号给抗原递呈细胞或B淋巴细胞,调节它们的免疫功能,以达到调控机体免疫应答的目的。另外,可溶性CD28(CD28-Ig)可以通过B7-1、B7-2促进DCs分泌IL-6和IFN-γ:CD28-Ig处理过的DCs可以增强机体T细胞介导的抗肿瘤、抗微生物免疫应答以及MHC-I类抗原限制性迟发型变态反应。由此可见,B7-CTLA-4和B7-CD28均可以互为配受体,具有双向传递信号的能力；也反映出共刺激分子对机体免疫功能的调节是复杂的、多样性的。 除了B7家族成员可以传递反向信号之外,TNF家族成员也有相似功能。最近报道的TNFR超家族成员GITR与其配体GITRL便可互为配受体,可以双向传递信号,调控免疫反应。LIGHT作为TNF家族的新成员,可以作为共刺激分子,为Τ细胞的活化提供刺激信号,同时还可以诱导骨髓增生异常综合征(MDS)病人来源的未成熟DCs的成熟。这些已有的相关研究都主要集中在LIGHT与不同的受体结合之后,发挥的不同生物学功能,那么LIGHT自身是否也可以向其表达细胞传递信号,它与其受体之间是否也互为配受体,目前尚未见报道。 本课题就上述问题展开研究,用LTβR-Ig融合蛋白作为工具,初步探讨LIGHT是否可以传递信号作用于未成熟DCs,对未成熟DCs的表型及功能产生影响,进而起到免疫调节作用。所得研究结果,将进一步丰富LIGHT-共刺激通路的理论知识。 第一部分 验证LTβR-Ig融合蛋白可与未成熟DCs表面LIGHT有效结合 LTβR-Ig与未成熟DCs的有效结合是本课题的研究基础,因此必须对LTβR-Ig的生物学活性及其结合效力进行验证。 (1)首先检测LTβR-Ig的生物学活性 [方法]:将C57BL/6小鼠的脾脏单个核细胞作为反应细胞,BALB/C小鼠的脾脏单个核细胞经过丝裂霉素处理后,作为刺激细胞,两种细胞1:1混合培养,并加入LTβR-Ig或者对照人IgG,或与融合蛋白相同体积的PBS。3天后检测3[H]-TdR掺入量。 [结论]:单向混合淋巴细胞反应证实了LTβR-Ig可以有效阻断LIGHT-HVEM信号通路,对同种异基因混合淋巴细胞的增殖有明显的抑制作用。 (2)检测LTβR-Ig与未成熟DCs的特异性结合 [方法]:先用间接标记的方法,即先用大鼠抗小鼠LIGHT抗体与不同成熟状态的DCs结合,然后加入荧光标记的抗大鼠的二抗,流式细胞仪检测不同成熟状态的DCs表面LIGHT的表达水平。同样是间接标记法,再检测LTβR-Ig与未成熟DCs的结合效力,设抗LIGHT抗体阻断对照及IgG对照。 [结论]:LTβR-Ig可以特异性识别未成熟DCs表达的LIGHT。 第二部分 LTβR-Ig融合蛋白对小鼠未成熟DCs表型、抗原吞噬及递呈功能的影响 本部分实验以LTβR-Ig体外模拟LTβR与未成熟DCs表面LIGHT的结合,观察LIGHT被激活后,是否可以直接向未成熟DCs传递信号,对未成熟DCs的免疫表型、抗原吞噬能力和抗原递能力造成影响。 [方法]:用GM-CSF、IL-4体外扩增C578L/6小鼠骨髓来源的DCs,于扩增的第5天收集细胞,并用CD11c磁珠纯化,得到高纯度的未成熟DCs。然后体外继续培养,并在培养体系中加入LTβR-Ig(终浓度为5μg/ml)或相同终浓度的IgG或与融合蛋白等体积的PBS：①于加入蛋白后24h、48h分别检测DCs的免疫表型；②加入蛋白后24h收集各组DCs,用FITC标记的卵白蛋白(FITC-OVA)作为抗原,检测各组DCs对该抗原的吞噬能力,流式细胞仪检测PE-CD11c+DCs中,FITC-OVA+细胞的百分率及平均荧光强度,用以反映DCs的吞噬能力③收集不同蛋白作用24h后各组DCs,与CFSE预染的OVA323-339肽特异性CD4+T细胞混合培养84h,流式细胞仪检测CD4+T细胞CFSE的荧光强度,用以反应不同处理组DCs的抗原递呈能力。 [结论]:从DCs的免疫表型、抗原吞噬及抗原递呈功能等方面,初步说明ITβR-LIGHT信号通路可以反向传递刺激信号给未成熟DCs,诱导DCs的成熟。 第三部分 LTβR-Ig对DCs分泌细胞因子及抗原特异性CD4+T细胞生物学功能的影响 进一步深入探讨LTβR-Ig诱导DCs成熟的机制。 [方法]:用ELISA和Realtime-PCR的方法,分别从蛋白质水平和mRNA水平检测DCs分泌IL-12、IL-10、IL-6、TNF-a等细胞因子及趋化因子的水平。检测了DCs与OVA323-339肽特异性T细胞混合培养后,T细胞的胞内及上清中IL-2、IL-4、IFN-γ的表达水平。 [结论]:IL-6在DCs的成熟过程中发挥着重要作用。LTβR-Ig促进DCs成熟,促进抗原特异性CD4+T细胞分泌Th2型细胞因子均是通过促DCs高分泌IL-6实现的。 为了排除实验过程中可能存在的LPS污染,我们使用的所有金属器具均经过250℃高温烘烤30min以上,灭活LPS。所有塑料器具均是一次性无热源产品。此外,还实验证实了无LPS污染。 [方法]：将LTβR-Ig煮沸10min,使之完全变性之后再作用于未成熟DCs,观察未成熟DCs分泌IL-6的水平。 [结果]：煮沸后LTβR-Ig不能促进DCs高分泌IL-6,与对照组无差异。 [结论]：DCs分泌IL-6增高不是LPS污染导致的,而是LTβR-Ig与LIGHT特异性结合所引起的。 第四部分 LTβR/LIGHT信号通路对DCs及T细胞功能影响的体内实验研究 本部分主要是对体外实验的体内验证。 [方法]：①抗原特异性T淋巴细胞反应：将LTβR-Ig处理24h的C57BL/6小鼠骨髓来源的DCs,与CFSE预染的OVA323-339肽特异性CD4+T细胞按1:10的比例混合(DCs：5×105/只；T：5×106/只),经尾静脉回输入小鼠体内,同时尾静脉注射入200nmol的OVA323-339肽,在无病原菌的环境下饲养3天后处死动物。取脾和淋巴结的淋巴细胞,用PE-CD4流式抗体标记细胞,流式细胞仪检测脾及淋巴结中CFSE阳性细胞的增殖情况,ELISA检测血清中细胞因子的表达水平。②同种异体混合淋巴细胞反应：先将BALB/C小鼠的脾脏单个核细胞用CD4和CD8磁珠进行阳性筛选,得到富集的T细胞,并用CFSE染色。然后LTβR-Ig处理C57BL/6来源第5天DCs24之后,与CFSE预染的BALB/C小鼠来源的脾脏及淋巴结T细胞胞以1:10比例混合(DCs：5×105/只；T：5×106/只)后,经尾静脉注射入8Gry60Go照射后的正常BALB/C小鼠体内,3天后处死动物,取脾和淋巴结的淋巴细胞,用PE-CD4流式抗体标记细胞,流式细胞仪检测脾及淋巴结中CFSE阳性细胞的增殖情况,ELISA检测血清中细胞因子的表达水平。 [结果]：与体外实验一致,LTβR-Ig处理过的DCs回输入体内后,对抗原特异性T淋巴细胞反应以及同种异基因混合淋巴细胞的增殖,均起到刺激作用。并且促进T细胞分泌IL-4,部分增强Th2型免疫反应。 在本研究中,首次用LTβR-Ig融合蛋白为工具,研究LIGHT-信号通路是否存在反向信号。首先,用流式细胞术的方法证实LTβR-Ig可以与DCs表面的LIGHT分子有效结合,在此基础上研究LTβR-Ig通过LIGHT对DCs状态及功能的影响。从DCs细胞的免疫表型、细胞因子的分泌、吞噬能力和抗原递呈能力等各方面的实验结果均显示LTβR-Ig促进DCs的成熟,增强DCs对抗原特异性T淋巴细胞的刺激能力,提示LTβR-LIGHT对DCs的免疫功能存在反向调节作用。最后,通过尾静脉回输LTβR-Ig作用过的DCs,体内证实LTβR-Ig作用后的DCs可以促进抗原特异性CD4+T细胞反应。至于LIGHT其他两个受体是否也可以通过LIGHT向DCs传递类似的刺激信号,这需要进一步探讨。本研究所得结论将进一步丰富LIGHT-信号通路对免疫反应调控的理论知识。