【摘 要】
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H3K27me3作为独立于典型性印记之外的非典型性的印记方式,同样使受精后的雌原核能够继承卵母细胞中基因的沉默方式,从而调节基因的表达;同时H3K27me3也与早期胚胎中X染色体失活和和合子基因激活有很大的联系。PGC7是卵母细胞和早期胚胎发育中重要的母源效应蛋白,在印记基因保护、细胞周期调节、染色质凝缩等方面发挥重要作用。我们前期发现PGC7是一个固有无序蛋白,主要通过与其他蛋白进行互作而行使功
【基金项目】
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国家自然科学基金（编号:31872355）；
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H3K27me3作为独立于典型性印记之外的非典型性的印记方式,同样使受精后的雌原核能够继承卵母细胞中基因的沉默方式,从而调节基因的表达;同时H3K27me3也与早期胚胎中X染色体失活和和合子基因激活有很大的联系。PGC7是卵母细胞和早期胚胎发育中重要的母源效应蛋白,在印记基因保护、细胞周期调节、染色质凝缩等方面发挥重要作用。我们前期发现PGC7是一个固有无序蛋白,主要通过与其他蛋白进行互作而行使功能,而且在细胞中PGC7分别能够与AKT和EZH2发生互作,并促进AKT磷酸化抑制EZH2,从而调节H3K27me3的水平。在此结果的基础上,本研究主要探讨PGC7在小鼠合子期对EZH2介导的H3K27me3水平的影响,揭示PGC7缺失小鼠早期胚胎发育缺陷的原因。通过CRISPR/Cas9技术制备了PGC7基因敲除小鼠,使用免疫荧光、蛋白质免疫印记和实时荧光定量PCR等方法,在PGC7敲除或AKT抑制的受精卵中,研究EZH2及H3K27me3在原核中的分布以及相应基因的表达变化研究结果如下:1.本研究制备了PGC7基因敲除小鼠,测序结果显示有多种突变方式,挑取缺失13bp的突变体进行繁殖,使用PCR方法进行检测及后代筛选。PGC7基因敲除小鼠和对照小鼠各个器官的HE染色组织切片结果显示敲除小鼠的器官组织结构无异常,但是脾脏和肝脏更加深染。PGC7基因敲除小鼠早期胚胎培养发现,受精卵（48.33±2.68%）停滞在2～4细胞,囊胚率只有（2.33±0.47%）。统计敲除小鼠的体重发现,PGC7双等位基因敲除（Pgc-/-）的小鼠发育缓慢,比同周龄野生型(Pgc+/+)小鼠体重显著下降（19.70±2.05%）（P<0.05）。2.Western Blot检测MII期卵母细胞和受精卵中AKT的活性,发现p AKT-S473在PGC7单等位基因敲除(Pgc7+/-)小鼠卵母细胞中水平下降,而在Pgc7-/-受精卵中可能通过某种代偿机制得到恢复。通过免疫荧光技术检测到EZH2在Pgc7+/-受精卵原核中分布增加,H3K27me3的水平增高（P<0.05）,PGC7-/-受精卵中结果更加显著。证明EZH2的核定位以及H3K27me3的水平可能受到AKT活性的影响。3.为了验证EZH2在受精卵中的定位变化受到AKT活性的调节,使用AKT的抑制剂MK2206和激活剂SC79处理受精卵,免疫荧光结果发现MK2206抑制AKT导致EZH2和PGC7的原核定位均增加,相应的H3K27me3的水平也增高,SC79激活AKT导致EZH2和PGC7的原核定位均减少,相应的H3K27me3的水平也降低（P<0.05）。4.构建了EZH2第21位丝氨酸模拟磷酸化突变体EZH2-S21D和不能磷酸化的突变体EZH2-S21A,转染至3T3细胞。免疫荧光染色发现EZH2-S21D的荧光信号主要在胞质当中,EZH2-S21A则主要在核内。Western Blot结果表明,转染了EZH2和EZH2-S21A载体的细胞H3K27me3水平无显著差异,而转染EZH2-S21D突变载体的细胞H3K27me3水平显著降低,说明EZH2第21位丝氨酸磷酸化会导致EZH2活性降低,从而使H3K27me3水平下降。使用MK2206处理会升高H3K27me3水平,说明AKT的抑制会增加H3K27me3的水平。5.筛选出受H3K27me3调节同时又在合子期激活的基因,使用实时荧光定量PCR检测:PGC7的缺失导致在2-cell期Gab1、Jade1、Bbx和Etv6的表达显著下降;MK2206处理导致上述基因表达下降而SC79处理后结果相反（P<0.05）。综上所述,本研究通过CRISPR/Cas9系统构建了PGC7敲除小鼠模型,证实了PGC7敲除对小鼠早期胚胎发育和出生后发育都有重要的影响,同时证明PGC7可能通过AKT调节EZH2在原核内的分布,进而影响合子基因组H3K27me3水平。
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