论文部分内容阅读
传染性法氏囊病(IBD)是由传染性法氏囊病病毒(IBDV)引起的一种危害雏鸡的急性和高度接触性传染病。IBDV能够造成靶细胞(B细胞前体细胞)的损伤,引起免疫抑制和疫苗免疫失败,从而增加机体对其他病原体的易感性。MicroRNAs(miRNAs)是一类约22个核苷酸大小的单链RNA分子,这类分子能够通过与靶基因的结合而调控基因转录后的翻译过程。目前已知,miRNAs参与多种细胞生命活动过程并且在宿主的抗病毒反应中扮演重要角色,然而在IBDV感染和致病过程中miRNA起何作用尚不十分清楚。在本研究中,利用IBDV感染DF-1细胞并检测IBDV感染前后宿主细胞内miRNAs表达的变化。根据获得的高通量测序结果,从中筛选出8条miRNAs作为进一步研究对象,通过检测miRNAs对IBDV病毒复制的影响,发现miR-130b和miR-454能够明显地抑制病毒蛋白的表达,进一步通过qRT-PCR、Western Blot、IFA、TCID50等方法,在蛋白水平、mRNA水平以及病毒复制水平证明miR-130b和miR-454能够抑制IBDV在DF-1细胞中复制。此外,I型干扰素作为重要的抗病毒分子,在宿主的抗病毒反应中扮演着重要的角色,利用qRT-PCR检测poly(I:C)刺激或IBDV感染后DF-1细胞中1型干扰素的表达水平发现,miR-130b和miR-454能够明显增强DF-1细胞中IFN-β和转录因子IRF3以及p65的mRNA水平。然而抑制miR-130b或miR-454后,IFN-β、IRF3和p65的mRNA水平又明显下降。实验结果证明miR-130b和miR-454能够抑制IBDV复制并且增强宿主Ⅰ型干扰素的表达。为了探究miRNAs发挥作用的机理,利用多个生物信息学软件对miRNAs在IBDV基因组和宿主细胞内的靶点进行了预测,结果发现IBDV基因组上存在能与miR-130b和miR-454的种子区互补结合的区域。为了验证miRNAs对其靶基因的作用,利用qRT-PCR、Western Blot以及双荧光素酶报告系统检测靶基因表达情况,结果证实miRNAs能够抑制靶基因的mRNA及蛋白表达。进一步研究表明,宿主细胞内的细胞因子信号转导抑制因子5(SOCS5)以及细胞因子信号转导抑制因子6(SOCS6)分别为miR-130b与miR-454的靶基因,并且miR-130b和miR-454能够抑制靶基因的转录及翻译。SOCS家族蛋白是JAK-STAT通路信号转导的抑制因子,通过检测miRNAs对STATs的表达及STAT1磷酸化的影响发现,miR-130b和miR-454能够明显提高STATs基因转录水平以及STAT1在701位酪氨酸的磷酸化水平。然而抑制miRNA表达后,STAT1磷酸化水平有明显的下降。综上所述,本研究发现miR-130b和miR-454通过直接靶向作用于IBDV基因组抑制病毒复制,同时还可以通过抑制宿主细胞内靶基因SOCS的表达上.调IFN-β的表达水平,增强宿主抗病毒应答。这些结果说明miR-130b和miR-454在宿主抵抗IBDV感染的过程中发挥重要作用。