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冠心病(Coronary Heart Disease, CHD)是当代威胁人类中老年健康的疾病之一,是造成中老年死亡的首要原因。因此,预防和治疗冠心病,降低其发病率已受到世界各国的关注。我国的CHD患病率和死亡率呈逐年上升趋势,据世界卫生组织(WHO)估计：到2020年左右,我国会迎来冠心病的“流行”顶峰。动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)是冠心病的主要病理基础。动脉粥样硬化发病机理的研究已经经历了一个半世纪,有关AS的发病机制学说数量众多,其中主要包括内皮损伤学说、脂质浸润学说、血栓源性学说、动脉平滑肌细胞增殖学说等。1999年,Ross R教授以新的论据在他的损伤反应学说的基础上,明确提出“As是一种炎症性疾病”,并逐渐为医学界所认可。研究证实,炎症参与了AS形成及发展的各个阶段,直至最终的血栓并发症。而近年来,免疫因素在AS的发生发展中的作用正在被人们认识并引起重视,更有学者提出AS是一种自身免疫性疾病。在AS中,多种参与免疫细胞和炎症因子构成了错综复杂的相互协同、相互影响的网络,炎症和免疫共同影响着AS的进程。T淋巴细胞(peripheral blood T cells, PBTCs)是动脉粥样硬化斑块中一种主要的免疫细胞。AS的病理改变特点为平滑肌细胞增殖、脂质沉积、巨噬细胞和淋巴细胞浸润、泡沫细胞形成。通过T细胞特异的CD3抗体染色,在AS发生、发展的各个时期都有不同程度的T淋巴细胞浸润,这些T细胞大部分处于激活状态,表达粘附分子和其他表面分子,分泌细胞因子并进行增殖。活动性斑块与稳定性斑块比较,T细胞显著增加。许多关于人类和啮齿目动物的研究证实,T淋巴细胞促进粥样硬化斑块的炎症反应,影响损害的进展及重塑。T细胞活化是其发挥病理生理作用的前提,其活化需要两个信号,第一个信号是T淋巴细胞表面的TCR-CD3复合物同抗原递呈细胞(APC)上的MHC-Ⅱ类抗原肽复合物结合,赋予免疫应答的特异性,但不引起T细胞增生和分泌细胞因子；第二个信号是抗原非特异性的共刺激信号,由T细胞上的共刺激分子与APC表面的配体结合所诱导,启动维持并调节活化级联反应,决定了T细胞是活化增殖,或者转变为无反应状态甚至凋亡。PD-L1 (programmed death-ligand-1)分子是B-7家族成员,其广泛表达于淋巴细胞及其它外周组织和细胞。有研究证实PD-L1具有2个受体：已经识别的受体PD-1(programmed death-1)和另一未知受体。即PD-L1与不同的受体相互作用,发挥正性和负性双重调控作用。PD-L1共刺激信号是否参与AS的发生发展过程,其作用机制是什么,目前也尚无定论。他汀类(Statins)药物属于甲基羟戊二酰辅酶A(HMG-COA)丕原酶抑制剂,可以降低血清胆固醇的含量,是治疗高脂血症和AS最常用的一类药物。研究表明,他汀类药物降低心血管疾病的发病率及死亡率不仅与其降脂作用有关,除此以外还与其他多种药理作用有关,他汀还具有包括改善内皮功能、增加NO生物利用率、抗氧化、稳定斑块、调节祖细胞、抗炎、免疫调节等多重血管保护作用。近年来,有关他汀类药物抗炎作用的研究日渐增多,但是目前其免疫调节功能的研究还不够完善。卡托普利属于血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂,可以抑制血浆和局部组织的肾素-血管紧张素系统(RAS)活性,降低后负荷,增加心排出量、抑制心肌及血管重构、抑制交感神经活性等作用,除此之外,有研究证实,ACEI类药物还具有抗炎、恢复和维持血管内皮功能、抗血小板聚集、抑制低密度脂蛋白氧化修饰等作用,但他汀类药物及ACEI类药物能否通过调节共刺激信号PD-L1表达,从而起到延缓AS进展的作用,值得进一步的研究和探索。第一部分：冠心病患者外周血T淋巴细胞PD-L1的表达目的：研究PD-L1在CHD患者PBTC上的表达,初步探讨其在AS发生发展中的意义。方法：选择CHD患者(41例)为研究对象,其中稳定性心绞痛(SA)患者21例,急性冠脉综合征(ACS)患者20例,19例经冠脉造影证实的非CHD患者为正常对照组,密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(PBMC),分别用流式细胞术及RT-PCR检测PD-L1蛋白及mRNA在T淋巴细胞上的表达情况。采用SPSS 13.0软件进行统计处理,所有数据均采用(X±s)表示。以P<0.05为差异有统计学意义结果：1.尼龙毛柱法分离T淋巴细胞,并流式鉴定CD3+T细胞纯度>80%。2.流式细胞术检测PD-L1蛋白表达：PD-L1在PBTC上的表达在SA患者组表达率为(19.657±2.588)%,ACS患者组为(20.114±3.265)%,正常对照组为(7.122±2.553)%。各组间PD-L1表达率差异具有统计学意义(P<0.001),且两组CHD患者的PD-L1表达率高于正常对照组；但SA组与ACS组差异没有统计学意义(P=0.607)。(见表1-3)。3.RT-PCR检测PD-L1mRNA在PBTC的表达：各组间表达PD-L1mRNA结果差异具有统计学意义(P<0.001)。PD-L1mRNA结果显示SA组患者表达量为0.421±0.084,ACS组为0.406±0.075,且高于正常对照组的0.211±0.064；SA组与ACS组比较差异没有统计学意义(P=0.694)(见表1-4)结论：PD-L1在冠心病患者PBTCs上的表达升高,这可能在AS的发生及发展中起到作用。第二部分辛伐他汀及卡托普利分别对冠心病患者外周血T淋巴细胞PD-L1表达的干预作用目的观察辛伐他汀和卡托普利对PD-L1在CHD患者PBTC表达的调节作用,初步探讨他汀药物及ACEI类药物的免疫学调节AS的新机制。实验步骤1、辛伐他汀(Simvastatin)溶液的配制：将辛伐他汀4.186mg溶于2mL无水乙醇,加入1.8mL0.1mol/LNaOH,80℃,加热4h,用0.1mol/LHCl调pH值约为7.2,加蒸馏水定容至10mL,制成1mmol/L辛伐他汀储备液,再用蒸馏水稀释、过滤除菌后制成浓度为lumol/L辛伐他汀溶液,4℃冰箱保存备用。2、卡托普利(Captopril)溶液的配制：将卡托普利2.17mg溶于2mL无水乙醇,加热4h,在加蒸馏水10ml,制成1mmol/L储备液,再用蒸馏水稀释、过滤除菌后制成浓度为1umol/L置于4℃冰箱保存使用。3、选取8例冠心病病人,均为初发冠心病患者,并经冠状动脉造影证实,抽血前未服用各种心血管药物(包括他汀类药物)及其它免疫抑制剂4、无菌抽取8个病人新鲜抗凝的外周血2ml,充分混匀,加入96孔板中,每孔100ul,同一患者分为空白对照组、辛伐他汀药物处理组、卡托普利药物处理组,分别加入同等量的PBS溶液、辛伐他汀溶液、卡托普利溶液。使得辛伐他汀溶液浓度约为：110.32ug/L；卡托普利浓度约为：600.2ug/L,孵育12小时。5、用流式细胞术检测PD-L1蛋白在T淋巴细胞上的表达情况6、统计学处理：采用SPSS 13.0软件进行统计处理,所有数据均采用(X±s)表示。以P<O.05为差异有统计学意义。结果对照组、辛伐他汀组、卡托普利组PD-L1蛋白的表达量(见表2-1,图2-1、2-2、2-3)分别为：(13.446±5.535)%、(11.436±5.647)%、(11.744±5.509)%,CHD患者外周血在两种药物作用24小时后,T细胞上PD-L1蛋白表达下调。组间比较显示：辛伐他汀组及卡托普利分别与空白对照组比较差异具有统计学意义(P<0.001)；而辛伐他汀组与卡托普利组之间差异无统计学意义(P=0.475)。各组间差异有统计学意义(P<0.001),说明分组配伍有效,(见表2-1)。结论：在辛伐他汀、卡托普利作用冠心病患者外周血后,PD-L1在PBTC上的表达下降,这可能在AS的发生及发展中起到作用。