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目的排斥性导向分子(repulsive guidance molecule,RGMa)是中枢神经系统受损后过度表达的抑制轴突再生的蛋白之一,具有轴突排斥及诱导生长锥塌陷的作用。生长锥塌陷后,轴突的结构受到严重破坏,将导致神经突起间联系的中断,细胞间信息的传递受阻,最终导致神经功能的损害。在脑缺血/再灌注损伤动物模型中,观察到其明显抑制轴突再生、阻碍神经功能恢复的不良影响。同时发现在成年人局灶性缺血的脑片中,RGMa免疫阳性的细胞主要聚集在梗死区白质、出血区、梗死中心及梗死区周围。因此,通过特异性RNA干扰(RNA interference,RNAi),抑制其基因转录水平,进而下调蛋白表达,可能有助于轴突的再生及神经功能的恢复。此外,目前对于RGMa发挥抑制作用的细胞内信号途径并不清楚,可能与Rho激酶(Ras homologous kinase,Rho-kinase)下游分子塌陷反应介导蛋白-2(collapse response mediator protein-2,CRMP-2)有关。为了寻找到更合适的干预靶点,使缺血性损伤后的神经再生更为容易,神经功能的康复更为完全,对其作用机制的探索显得非常重要。本研究的结果,更为基础研究向临床应用转化提供了良好的理论依据。方法1.成年雄性SD大鼠132只,随机分为:正常组,假手术组,MCAO/再灌注组,PBS注射组,rAd-HK组,rAd-shRGMa组,取手术后第2天、第7天为两个观察时间点,采用“线栓法”制作MCAO/再灌注模型,缺血侧皮质立体定向注射RGMa特异性重组腺病毒rAd-shRGMa及空载体,通过RT-PCR、免疫组织化学/荧光方法检测缺血侧脑皮质内RGMa与CRMP-2 mRNA、蛋白的表达水平;2.成年雄性SD大鼠66只,分组同上,制作MCAO/再灌注模型,给予腺病毒干预,采用免疫组织化学方法检测缺血侧皮质内NF200的表达;3.对各组大鼠进行神经功能评分;4.成年雄性SD大鼠48只,随机分为:正常组,MCAO/再灌注组,rAd-HK组,rAd-shRGMa组,用Western blot检测RGMa、CRMP-2、pCRMP-2蛋白的表达,采用统计学方法对各分子间蛋白表达的关系进行相关性分析;5.新生鼠皮质神经元原代培养,采用细胞免疫荧光方法进行神经元鉴定、纯度计算,以重组的RGMa蛋白体外诱导,光镜下观察神经元轴突形态、长度变化,用Western blot检测pCRMP-2随时间变化的规律;6.新生鼠皮质神经元原代培养,于重组RGMa体外诱导前,进行Rho-kinase及GSK-3β特异性阻滞预处理,用Western blot检测细胞内pCRMP-2的表达水平。结果1. MCAO/再灌注后,大鼠缺血侧皮质内RGMa mRNA及蛋白表达明显升高(p<0.01),而CRMP-2表达显著降低(p<0.01);用rAd-shRGMa干预后,大鼠在第2天时的RGMa水平较MCAO/再灌注组显著降低(p<0.01),CRMP-2水平明显升高(p<0.01),至第7天时基本接近正常水平。2. MCAO/再灌注后,缺血侧皮质内pCRMP-2蛋白水平显著升高(p<0.01),此时轴突破坏最为严重,NF200表达明显减少(p<0.01),大鼠神经功能缺损明显(p<0.01)。而rAd-shRGMa组大鼠的pCRMP-2蛋白水平明显降低(p<0.01),部分轴突得到保存,但大鼠神经功能未见显著改善(p>0.05);至第7天时,pCRMP-2水平仅稍高于正常水平(p<0.01),NF200表达明显增多(p<0.01),大鼠的神经功能缺损已不明显(p<0.01)。3. MCAO/再灌注组大鼠缺血侧皮质pCRMP-2蛋白表达与RGMa蛋白表达pCRMP-2呈直线正相关(r=0.994),与NF200呈直线负相关(r=-0.895)。4.离体原代培养的皮质神经元存活状态良好,胞体丰满,轴突生长正常,纯度在90%以上。5.加入重组RGMa培养后,各孔神经元轴突明显回缩(p<0.01),细胞透光性欠佳,大部分神经元仅见胞体,而轴突基本消失;在Y-27632、GSK-3βinhibitor联合RGMa培养孔里,神经元轴突回缩现象较单纯RGMa培养孔有所改善(p<0.01)。6.随着RGMa诱导时间的延长,细胞内pCRMP-2的水平逐渐升高,6 h起即高于正常水平(p<0.01),到24 h达到高峰(p<0.01),以后开始下降,48 h的水平与6 h没有显著性差异(p>0.05);经Rho-kinase及GSK-3β特异性抑制剂预处理后的神经元,对RGMa的诱导作用出现明显抵抗,pCRMP-2水平与正常时无统计学差异(p>0.05)。结论脑缺血/再灌注后皮质内RGMa及pCRMP-2水平明显增高,腺病毒介导的RGMa特异性RNAi可以明显降低RGMa的表达,抑制CRMP-2的磷酸化,从而促进轴突再生及神经功能的恢复。RGMa可能是通过同时激活Rho-kinase及GSK-3β信号通路调控CRMP-2的磷酸化,介导神经元轴突缩短的。