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实验动物病毒检测是保证实验动物质量和动物实验结果的重要手段,国家标准中规定的实验动物病毒血清学检测方法主要为IFA,IEA和ELISA。目前,这些方法分散在我国为数不多的实验室中,阳性对照血清主要来自自然感染的动物血清,质量控制不严密,检测结果存在较大误差。本实验室成熟的病毒血清学检测方法有IFA、IEA,因此,在原有检测基础上,制备免疫质量控制血清,建立ELISA检测体系,实现一种病毒多种检测方法间的比对研究。同时,建立病原PCR检测方法,加强病毒检测水平,进一步完善实验室检测体系。实验选择5种病毒:小鼠脑脊髓炎病毒(TMEV)、鼠痘病毒(Ect)、淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)、多瘤病毒(POLY)和小鼠肺炎病毒(PVM),均为清洁级和SPF级实验动物必须排除的病原体。本研究通过制备组织毒,免疫BALB/c小鼠,待抗体滴度达到峰值时,采血收集免疫血清,制备了TMEV、Ect、LCMV、POLY、PVM标准化血清。IFA、IEA评价血清的敏感性和特异性。IFA及IEA法检测上述免疫血清效价依次分别为1:640、1:320,1:640、1:320,1:1280、1:640,1:640、1:640,1:640、1:320。本研究制备同批次大量免疫血清,敏感性高、特异性好,均可作为实验动物病毒检测中的标准质控血清使用。本研究建立了TMEV和痘苗病毒ELISA检测方法。用TMEV和痘苗病毒感染BHK-21细胞,制备病毒特异抗原,确定包被抗原和标准阳性血清的最佳工作浓度;并进行敏感性、特异性、重复性和稳定性实验。包被抗原和标准阳性血清的最佳工作浓度分别为2.5μg/mL和1:200,检测灵敏度为1:3200,与小鼠肺炎病毒、小鼠肝炎病毒、仙台病毒、呼肠孤病毒-Ⅲ型均无交叉反应,批内、批间特异抗原和正常抗原的变异系数均小于10%,将TMEV和痘苗病毒抗原包被的酶标板,置37℃进行加速破坏性保存实验,2d相对偏差均小于20%。TMEV和痘苗病毒ELISA检测方法和赠送ELISA试剂盒比较:相对敏感性依次为100%、92.9%,符合率依次为90.48%、93.3%。本研究建立的TMEV和痘苗病毒ELISA检测方法重复性、稳定性好,敏感性和特异性强,可用于TMEV抗体和Ect抗体的检测。同时,进行病原学检测方法的尝试,针对LCMV和POLY分别建立了巢式RT-PCR和PCR检测方法。利用巢式RT-PCR,扩增LCMV病毒RNA GP基因上长度为149bp的片段,克隆测序后,经BLAST在线比对分析证实,其核苷酸序列与Genebank中LCMV GP基因序列的同源性为99.32%;利用PCR扩增POLY病毒DNA基因上602-874之间的长度为272bp的片段。本研究初步解决目前实验动物病毒检测方法单一,缺乏比对,质量控制血清来源混乱、小批次不标准、不规范等问题,为进一步增强我国实验动物病毒检测方法研究,提高检测基础水平提供思路。