论文部分内容阅读
狂犬病毒(Rabies virus)属弹状病毒科(Rhabdoviridaes)狂犬病毒属(Lyssavirus),是有包膜的单股负链RNA病毒。该病毒具有较强的神经组织嗜性,是致死性传染病-狂犬病的病原体。狂犬病病死率可达100%,目前尚无有效治疗药物。我国是狂犬病严重流行国家之一,近年来,我国狂犬病的疫情呈快速上升趋势,形成了自1950年以来的第三次大流行。因此建立狂犬病毒安全、快速并特异的实验室检测方法以提高狂犬病的实验室监测能力对狂犬病的防控非常必要。狂犬病毒含5个结构蛋白,其中N蛋白是狂犬病毒的主要组成部分,其一级结构高度保守,存在着较高的狂犬病毒属的抗原交叉性,常作为狂犬病毒筛查和诊断应用的首选检测用抗原。pFastbac-to-bac杆状病毒表达系统通过外源基因特异性位点的转座作用可对外源基因进行高效的表达。该系统除了具有传统杆状病毒表达系统产量高、易纯化、安全性高、对翻译后蛋白进行加工修饰等优点,还能利用表达载体N端多聚组氨酸标签对目的蛋白进行纯化。因此本研究选择pFastBac-to-Bac杆状病毒表达系统对狂犬病病毒国际标准攻击强毒株(CVS-11)N基因进行表达,为检测试剂的研发和进一步建立实验室检测方法奠定基础。本实验应用RT-PCR方法扩增获得CVS-11 N基因片段,克隆入杆状病毒供体质粒pFastBac中,构建克隆有CVS-11 N基因的重组质粒pFastBac-N;将pFastBac-N转化DH10Bac E.coli感受态细胞,获得CVS-11 N基因杆状病毒重组表达质粒Bacmid-N;脂质体介导Bacmid-N转染Sf9昆虫细胞,60h后Sf9细胞出现了明显病变,提取转染后细胞DNA,PCR鉴定结果表明成功获得了表达CVS-11株N基因的P1代重组杆状病毒(AcMNPV-N)。AcMNPV-N连续接种两代细胞扩增病毒,获P3代AcMNPV-N感染Sf9单层细胞,40h后收获细胞进行DFA、SDS-PAGE和Western-blot鉴定。DFA结果显示,感染AcMNPV-N的Sf9细胞浆出现明显的绿色荧光,而对照细胞无荧光。SDS-PAGE、Western-blot结果显示成功表达了CVS-11 N蛋白,且与抗RV高免血清和抗RV NP单克隆抗体均能发生很好的结合反应。直接ELISA法分析蛋白表达情况显示CVS-11 N蛋白以胞内方式表达;用感染重组病毒AcMNPV-N的Sf9细胞与暴露前用狂犬病毒疫苗(CTN株)免疫的人血清进行间接免疫荧光试验,结果可以客观反映免疫后的抗体水平。综上所述,本实验成功构建了表达狂犬病毒CVS-11核蛋白的重组杆状病毒,CVS-11核蛋白在Sf9昆虫细胞中获得表达;表达的蛋白分子量约为50.5KDa,与天然NP分子量相符,并保持了天然NP良好的抗原性,可以应用于免疫学检测方法和检测试剂的研发。