背景动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)及其并发症引起的急性心血管病事件已成为人类的头号杀手,其防治一直是世界性公共卫生的重点和难题。急性冠状动脉综合征(acute coronary syndrome, ACS)是冠状动脉粥样硬化性心脏病最重要的死因。ACS的病理生理基础是冠状动脉内粥样斑块的破裂引发血栓形成,导致冠状动脉急性管腔狭窄或闭塞。ACS最主要的深层原因是易损斑块的形成,即易于发生血栓或可能迅速进展成为罪犯病变的斑块。易损斑块内部大量单核巨噬细胞聚集浸润,是斑块局部主要的炎症细胞。在氧化低密度脂蛋白等作用下,单核巨噬细胞活化,聚集、粘附和迁移至动脉内膜下,并分泌细胞因子、促有丝分裂因子、趋化因子、金属蛋白酶和其他蛋白水解酶,进一步激活炎症反应；同时吞噬脂质形成泡沫细胞,构成动脉粥样硬化斑块的基础。因此,巨噬细胞活化在急性冠脉综合征的发生发展过程中发挥至关重要的作用。巨噬细胞上的K+通道主要有电压依赖性钾通道(voltage dependent potassium channel, Kv)和Ca2+依赖性钾通道(Ca2+activated potassium channel, Kca)两大类,其中Kv通道是静息巨噬细胞活化的关键。电压门控钾通道Kv通过调节巨噬细胞静息膜电位间接调节细胞增殖及细胞因子产生；同时,Kv通道在调节细胞容积及巨噬细胞黏附、迁移中也发挥重要作用。电压依赖性钾通道Kv1.3是电压依赖性钾通道Kv1家族主要的表达亚型之一,由6个α螺旋组成的4组蛋白质亚单位6次跨膜形成单孔道通道,当膜电位高于-40mv时通道开放,并呈频率依赖性失活。本研究提出如下假说：电压依赖性钾通道Kv1.3可能参与了急性冠脉综合征单核巨噬细胞的活化过程,从而在动脉粥样硬化易损斑块的发生发展中发挥重要的调节作用。目的1.观察人单核巨噬细胞膜钾电流及Kv1家族通道蛋白表达情况；2.探讨ACS患者单核巨噬细胞Kv钾电流的变化情况；3.探讨ACS患者单核巨噬细胞电压依赖性钾通道Kv1.3的表达情况。方法本研究以原代培养的人单核巨噬细胞为研究对象,采用全细胞膜片钳技术、实时定量逆转录聚合酶链反应(real time RT-PCR)、蛋白免疫印迹(Western Blot)等实验方法,观察：1.全细胞膜片钳技术检测巨噬细胞电流密度变化情况；2.RT-PCR技术检测单核源巨噬细胞Kv1.3mRNA表达情况；3. Western Blot技术检测巨噬细胞Kv1.3蛋白表达情况结果1.临床标本一般资料分析与正常对照组相比,不稳定型心绞痛组和急性心肌梗死组低密度脂蛋白水平明显升高(P<0.05)。四组间年龄,性别比,血糖,高血压,吸烟者所占比例及药物治疗比例差异无统计学意义(P>0.05),四组之间具有可比性。2.巨噬细胞Kv电流鉴定电极内液中的EGTA使液体内游离Ca2+浓度维持于极低浓度,最大程度的减少Ca2+激活钾电流的影响,全细胞膜片钳记录膜离子流；4-AP作用后该电流明显抑制,提示记录电流为Kv钾电流。3.四组之间巨噬细胞膜电容及Kv电流比较四组间巨噬细胞膜电容差异无统计学意义(P>0.05)。与正常对照组相比,不稳定型心绞痛组巨噬细胞Kv峰值电流密度显著升高(P<0.01),急性心肌梗死组巨噬细胞Kv峰值电流密度亦显著升高(P<0.01),稳定型心绞痛组Kv峰值电流密度差异无统计学意义(P>0.05)。4.巨噬细胞中Kv1通道的表达巨噬细胞自然分化第7天检测Kv1家族通道核酸表达水平,结果显示以Kv1.3表达为主。5.四组巨噬细胞Kv1.3通道mRNA的表达与正常对照组相比,不稳定型心绞痛和急性心肌梗死组巨噬细胞Kv1.3mRNA的表达均明显升高(P<0.01)；稳定型心绞痛组巨噬细胞Kv1.3mRNA的表达无统计学差异(P>0.05)。6.四组巨噬细胞Kv1.3通道蛋白表达水平与正常对照组相比,不稳定型心绞痛和急性心肌梗死组巨噬细胞Kv1.3蛋白表达水平明显升高(P<0.01)；稳定型心绞痛组巨噬细胞Kv1.3蛋白表达无明显变化(P>0.05)。结论1.急性冠脉综合征患者单核巨噬细胞Kv钾电流电学特征未发生改变,但电流密度明显增高；2.单核巨噬细胞电压依赖性钾通道Kv1家族的表达以Kv1.3为主；3.急性冠脉综合征单核巨噬细胞Kv1.3通道核酸及蛋白表达水平均明显增加。背景巨噬细胞在AS发生发展过程中发挥重要的作用,单核巨噬细胞聚集、粘附、浸润至动脉内膜下,吞噬氧化低密度脂蛋白(ox-LDL),形成泡沫细胞都有赖于单核巨噬细胞的直接参与和作用。活化的巨噬细胞趋化浸润血管壁,损伤血管内皮细胞,同时分泌产生各种金属蛋白酶包括胶原蛋白酶来降解细胞外基质和削弱纤维帽使其变薄,从而使稳定的斑块转为易损斑块,部分易损斑块破裂促使血小板聚集,进而导致冠状动脉内血栓形成。氧化低密度脂蛋白是引起巨噬细胞活化的主要物质之一,在AS早期及晚期易损斑块内,常有大量ox-LDL蓄积。ox-LDL具有致AS的特性,通过诱导单核趋化蛋白-1的表达,具有对单核巨噬细胞的趋化作用；提高血管内皮细胞粘附分子-1、细胞间粘附分子-1、P-选择素等的表达；并且能调控炎症活动相关的信号通路,从而影响动脉粥样硬化过程中巨噬细胞的活化。巨噬细胞膜上的电压依赖性钾通道Kv是静息巨噬细胞活化的关键。Kv通道有2个基本特点：①电压依赖性开放；②对K+具有高度的选择性。研究发现,巨噬细胞电压依赖性钾通道Kv主要由电压依赖性Kv1家族中的Kv1.3基因编码。Kv通道能够通过调节巨噬细胞静息膜电位间接调节细胞活化必须的Ca2+信号,从而在细胞容积调节、细胞因子分泌及细胞增殖中发挥重要作用。因此,本研究提出如下假说：电压依赖性钾通道Kv1.3可能参与了ox-LDL诱导的巨噬细胞的活化,从而在动脉粥样硬化易损斑块的发生发展过程中发挥重要作用。目的1.观察ox-LDL对巨噬细胞钾通道Kv1.3表达的影响；2.阐明Kv1.3对ox-LDL诱导的巨噬细胞钾电流的影响；3.探讨Kv1.3在ox-LDL诱导的巨噬细胞活化中的作用。方法本研究以原代培养的单核巨噬细胞为研究对象,采用实时定量逆转录聚合酶连反应(real time RT-PCR)、蛋白免疫印迹(western blot)、膜片钳技术、酶联免疫吸附法(ELISA)、Transwell等实验方法,观察：1.不同浓度(0、5、10、20、40、80μg/ml)的ox-LDL、LDL处理巨噬细胞不同时间(0、4、8、12、24、48h)后,检测Kv1.3mRNA和蛋白含量；2.Kv1.3过表达载体的构建；3.设计、合成、筛选Kv1.3siRNA;4.分别过表达和基因沉默Kv1.3基因后,全细胞膜片钳技术观察巨噬细胞钾电流的变化；5.分别过表达和基因沉默Kv1.3基因后,Transwell法观察巨噬细胞趋化能力改变；6.分别过表达和基因沉默Kv1.3基因后,ELISA检测TNF-α分泌情况。结果1. ox-LDL对巨噬细胞Kv1.3表达的影响分别加入0μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml、80μg/ml的ox-LDL,孵育巨噬细胞24h后发现,ox-LDL能浓度依赖性的上调巨噬细胞Kv1.3mRNA表达。与正常对照组相比,40μg/ml ox-LDL处理细胞24h后Kv1.3mRNA开始明显增加(P<0.01),80μg/ml ox-LDL刺激作用最强(P<0.01)。40μg/ml的ox-LDL分别处理巨噬细胞0h、4h、8h、12h、24h、48h后,发现ox-LDL刺激巨噬细胞Kv1.3mRNA表达上调呈时间依赖性。ox-LDL处理细胞24h后Kv1.3mRNA开始明显增加(P<0.01),48h后Kv1.3mRNA亦明显增加(P<0.01)。Western Blot进一步证实,40μg/ml的ox-LDL处理巨噬细胞24h后,Kv1.3蛋白表达量亦显著增加。2. ox-LDL对巨噬细胞存活率的影响分别加入0μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml、80μg/ml的ox-LDL,孵育24h后,MTT检测巨噬细胞的存活率,结果显示80μg/ml ox-LDL处理的巨噬细胞存活率显著下降(P<0.01)。采用40μg/ml ox-LDL分别处理巨噬细胞0h、4h、8h、12h、24h、48h后,发现ox-LDL处理细胞48h后巨噬细胞的存活率显著下降(P<0.05)。因此,选择40μg/ml ox-LDL处理巨噬细胞24h作为处理条件。3.Kv1.3对ox-LDL诱导的巨噬细胞钾电流的影响与对照组相比,巨噬细胞过表达Kv1.3后,Kv峰值钾电流密度升高(P<0.01)；过表达Kv1.3的巨噬细胞经ox-LDL处理后Kv峰值钾电流密度明显增加(P<0.01);但Kv1.3过表达和ox-LDL处理之间无交互作用(P=0.36)。Kv1.3siRNA转染巨噬细胞后,与对照组相比,Kv1.3基因沉默的巨噬细胞Kv峰值钾电流密度减少(P<0.01)；与ox-LDL处理组相比,siKvl.3/ox-LDL组巨噬细胞Kv峰值电流密度明显降低(P<0.01)；Kv1.3基因沉默与ox-LDL处理之间存在交互作用(P<0.01),为拮抗作用。4.Kv1.3对ox-LDL诱导的巨噬细胞迁移功能的影响与对照组相比,巨噬细胞过表达Kv1.3后,细胞迁移率升高(P<0.01)；过表达Kv1.3的巨噬细胞经ox-LDL处理后迁移率亦明显增加(P<0.01)：但Kv1.3基因过表达与ox-LDL处理之间不存在交互作用(P=0.55)。Kv1.3siRNA转染巨噬细胞后,与对照组相比,Kv1.3基因沉默的巨噬细胞迁移率明显减少(P<0.05)；与ox-LDL处理组相比,siKv1.3/ox-LDL组巨噬细胞迁移率明显降低(P<0.01)；Kv1.3基因沉默与ox-LDL处理之间存在交互作用(P<0.05),为拮抗作用。5.Kv1.3对ox-LDL诱导的巨噬细胞分泌功能的影响与对照组相比,巨噬细胞过表达Kvl.3后,细胞因子TNF-a分泌含量增加(P<0.01)；过表达Kv1.3的巨噬细胞经ox-LDL处理后TNF-a含量亦明显增加(P<0.01)；但Kv1.3基因过表达与ox-LDL处理之间不存在交互作用(P=0.12)。Kv1.3siRNA转染巨噬细胞后,与对照组相比,Kv1.3基因沉默的巨噬细胞细胞因子TNF-a分泌含量明显减少(P<0.01)；与ox-LDL处理组相比,siKv1.3/ox-LDL组TNF-α分泌含量明显下降(P<0.01)；Kv1.3基因沉默与ox-LDL处理之间存在交互作用(P<0.01),为拮抗作用。结论1.ox-LDL呈浓度和时间依赖性刺激巨噬细胞Kv1.3表达；2.Kvl.3参与了ox-LDL诱导的巨噬细胞Kv钾电流的变化；3.Kv1.3参与了ox-LDL诱导巨噬细胞的趋化和分泌活动。背景电压依赖性钾通道是静息巨噬细胞活化的关键,Kv通道对K+具有高度选择性,且呈电压依赖性开放。电压依赖性钾通道Kv在细胞去极化后膜电位的重建过程中发挥重要作用,并与其他转运蛋白一起维持膜电位的稳定。随着对巨噬细胞电压依赖性钾通道研究增多,认为这些离子通道不仅调控细胞膜内外离子跨膜浓度梯度处于稳态,还与细胞膜信号蛋白密切相关,参与调控细胞各种功能活动。晚近研究发现巨噬细胞电压依赖性钾通道在巨噬细胞刺激分泌过程中起重要作用,可作为重要的信号通道蛋白参与巨噬细胞的活化。电压依赖性钾通道Kv通过调节静息膜电位来调节细胞内Ca2+浓度。巨噬细胞的静息膜电位膜内是负性,对膜外Ca2+通过细胞膜进入胞内具有促进作用；Kv通道开放,K+外流增加,形成超极化,促进Ca2+内流,增加胞内Ca2+浓度；Kv通道受阻,K+外流减少,细胞膜去极化,抑制Ca2+内流,降低胞内Ca2+浓度。因此巨噬细胞膜上的钾通道可以通过对Ca2+的调节,影响巨噬细胞的趋化和分泌等炎症反应过程。巨噬细胞活化的信号调控是一个复杂的网络体系,氧化低密度脂蛋白等各种刺激因子作用下,核因子-κB (NF-κB)、促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)等信号分子均参与巨噬细胞活化的调控过程。电压依赖性钾通道的开放,导致细胞膜的超极化,增加Ca2+的内流,从而激活MAPK等大量相关酶类,还能调节NF-κB信号通路。MAPKs和NF-κB信号途径的激活能导致巨噬细胞活化,进而在易损斑块发生发展中发挥重要作用。因此,本研究提出如下假说：电压依赖性钾通道Kv1.3介导巨噬细胞钙内流,通过调节Ca2+-MAPKs-NF-κB信号转导通路参与ox-LDL诱导的巨噬细胞活化,从而参与动脉粥样硬化易损斑块的发生发展。目的1.观察ox-LDL对巨噬细胞MAPks ERK1/2和NF-κB p65蛋白磷酸化的影响；2.探讨Kv1.3对ox-LDL诱导的巨噬细胞内Ca2+的调控作用；3.揭示Kv1.3对ox-LDL诱导的巨噬细胞MAPKs和NF-κB信号转导通路的影响。方法本研究以原代培养的人单核巨噬细胞为研究对象,分别以Kv1.3过表达质粒和siRNA转染巨噬细胞,采用膜片钳技术和蛋白免疫印迹(western blot)实验方法,观察：1.分别过表达和基因沉默Kvl.3基因后,观察巨噬细胞内Ca2+荧光强度的变化；2.分别过表达和基因沉默Kvl.3基因后,观察MAPks ERK1/2和NF-κB信号通路的变化。结果1.Kv1.3对巨噬细胞内Ca2+荧光强度的影响巨噬细胞过表达Kv1.3后,与对照组相比,Ca2+荧光强度明显增高(P<0.01)；与ox-LDL处理组相比,过表达Kvl.3的巨噬细胞经ox-LDL处理后Ca2+荧光强度进一步增加(P<0.01)。与对照组相比,siKv1.3组的Ca2+荧光强度明显降低(P<0.01)；与ox-LDL处理组相比,siKvl.3的巨噬细胞经ox-LDL处理后Ca2+荧光强度明显降低(P<0.01)。2.ox-LDL对巨噬细胞MAPKs信号转导通路活性的影响40μg/mL ox-LDL刺激巨噬细胞Oh、24h、48h后,结果显示,ox-LDL能刺激巨噬细胞ERK1/2磷酸化,磷酸化ERK1/2表达水平明显增加,并呈时间依赖性；总ERK表达水平无明显变化。3.Kv1.3对巨噬细胞MAPKs信号转导通路活性的影响巨噬细胞过表达Kvl.3后,与对照组相比,ERK1/2的磷酸化表达水平明显增高(P<0.01)；经ox-LDL处理组相比,过表达Kv1.3的巨噬细胞经ox-LDL处理后ERK1/2的磷酸化表达水平明显增加(P<0.01)。与对照组相比,siKv1.3组的ERK1/2的磷酸化表达水平明显降低(P<0.01)；与ox-LDL处理组相比,基因沉默Kvl.3的巨噬细胞经ox-LDL处理后ERK1/2的磷酸化表达水平明显降低(P<0.01)。4. ox-LDL对巨噬细胞NF-kB信号转导通路活性的影响40μg/mL ox-LDL刺激巨噬细胞16h、24h、48h后,结果显示,16h NF-κB p65的磷酸化表达水平增高(P<0.01),24h NF-κB的NF-κB p65的磷酸化表达水平达到最高(P<0.01),48h NF-κB p65的磷酸化表达水平开始降低(P<0.05)。5.Kvl.3对巨噬细胞NF-κB信号转导通路活性的影响巨噬细胞过表达Kv1.3后,与对照组相比,NF-κB p65的磷酸化表达水平明显增高(P<0.01)；经ox-LDL处理组相比,过表达Kv1.3的巨噬细胞经ox-LDL处理后NF-κB p65的磷酸化表达水平明显增加(P<0.01)。与对照组相比,siKv1.3组的NF-κB p65的磷酸化表达水平明显降低(P<0.01)；与ox-LDL处理组相比,基因沉默Kv1.3的巨噬细胞经ox-LDL处理后NF-κB p65的磷酸化表达水平降低(P<0.01)。结论1.电压依赖性钾通道Kvl.3能够通过影响膜电位进而影响细胞内钙离子浓度变化；2.电压依赖性钾通道Kv1.3通过参与Ca2+-MAPKs-NF-κB信号转导通路进而调节巨噬细胞活化。