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凝乳酶是一种能专一性切割乳液中κ酪蛋白的酶,随着K酪蛋白的切割,酪蛋白颗粒在乳液中的稳态被破坏,进而酪蛋白凝聚沉淀并与乳清分离。利用这一特性,凝乳酶被广泛用于干酪加工初期的凝乳过程。适合于干酪制作的凝乳酶要具备高凝乳活力和低非特异蛋白水解活力,它们的比值,即c/p值,是评价制备干酪凝乳酶品质优劣的一个重要指标。在干酪加工过程中,加入凝乳酶使乳液凝固,切割后排出乳清,但仍然会有少量凝乳酶存留在凝乳中,在干酪的成熟过程中,这些凝乳酶参与干酪中蛋白质的水解,对干酪出品率、质地和风味产生重要影响。根据凝乳酶来源不同,可将其分为动物皱胃酶(animal rennet,AR)、植物蛋白酶(plant-derived coagulant,PC)、微生物凝乳酶(microbial coagulant,MC)和重组凝乳酶(recombinant chymosin,RC 或 fermentation produced chymosin,FPC)。其中来源于小牛皱胃的凝乳酶,因为其较低的非特异蛋白水解活力,制备的干酪出品率高、质地优良而被广泛用于传统干酪的制作。重组凝乳酶是将动物凝乳酶的cDNA克隆到表达载体上,再转入微生物宿主中进行表达,通过下游的加工与纯化,获得重组凝乳酶。重组凝乳酶的生化特性与天然动物凝乳酶没有差别,且纯度高,用其制备干酪的品质与比得上小牛凝乳酶制备的干酪。目前重组凝乳酶被认为是最佳的小牛凝乳酶的替代品。现已上市并应用于干酪制备的重组凝乳酶有重组牛凝乳酶和重组单峰驼凝乳酶,这两种酶也是被研究得最多最热的重组凝乳酶。本研究选择上述两种重组凝乳酶作为表达与纯化的对象。通过化学方法合成牛凝乳酶原基因和单峰驼凝乳酶原基因的编码序列,将其成功构建到表达载体pET30a上,分别命名为pET30a-b-proCHY和pET30a-c-proCHY,并将这两个表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3),通过IPTG诱导获得了目的蛋白的高水平表达,表达量分别占总菌体蛋白的66.3%和61.4%。重组凝乳酶原在大肠杆菌中以包涵体形式存在,先通过6 mol/L尿素溶解包涵体,再用TE透析液(pH8.0)将尿素逐步透析去除,最终获得复性重组凝乳酶原,得率约为200mg/L。将重组牛凝乳酶原进行酸化/中和处理,即模拟体内凝乳酶原活化过程,将酶原溶液的pH调至2.0,活化2h,再将pH回调至6.0。我们发现将pH从2.0回调至6.0时,原本透明的溶液出现了大量白色浑浊物,放置一段时间后,溶液出现分层现象,上层清亮透明,下层为白色沉淀,也可通过离心处理加速上清与沉淀的分离。分别将自然沉降与离心处理的上清与沉淀取样进行SDS-PAGE检测,发现上清主要包含成熟的凝乳酶和his-propeptide融合肽,而下层白色沉淀除了含有一定量的凝乳酶外,还包含几乎所有的杂蛋白。若将上清吸出存放,用无菌蒸馏水重悬沉淀数次,可从沉淀中回收一定量的凝乳酶。因此,我们先对活化的酶原溶液进行离心,吸出上清后,用无菌蒸馏水重悬沉淀、再离心取上清,重复2次,将上清合并在一起,对牛凝乳酶进行初步纯化。在合并上清中加入不同终浓度的饱和硫酸铵(5%-50%)进行沉淀,发现当饱和硫酸铵终浓度为35%-50%时,凝乳酶被沉淀下来,而his-propeptide融合肽还保留在上清液中,故选择40-50%饱和硫酸铵对酶液进一步纯化,最终获得纯重组牛凝乳酶。检测纯化步骤中酶液的蛋白浓度、凝乳活力,计算得出经离心和饱和硫酸铵沉淀处理最终获得的纯化重组牛凝乳酶蛋白回收率为1.82%。大量蛋白在酸化/中和过程中沉淀而被去除,这可能是因为酶原在复性过程中,有部分酶原不能正确折叠,故在酸化过程被降解析出。我们还发现酶在纯化前后总活力提高了 73.3%,比活力提高了 94倍。这也许是纯化去除了his-propeptide和杂蛋白,减少了酶与底物结合阻碍。重组牛凝乳酶原及重组牛凝乳酶经冻干后复水保留完全活性,可添加NaCl制备成凝乳酶含量为33～50mg/g的分散颗粒便于保存和取用。对初步纯化的重组牛凝乳酶进行了酶学特性分析,并以商品化重组牛凝乳酶作为对照,结果显示该酶最适作用温度为57～62 ℃,并在pH2～7、小于40℃的温度范围内稳定。金属离子中Al3+,Fe3+和Cu2+能显著增强酶活;胃蛋白酶抑制剂pepstatinA对酶有明显的抑制作用。这些酶学特性与商品重组凝乳酶相似,故该酶具有商业化潜力。将重组单峰驼凝乳酶进行酸化/中和处理,用不同的pH对其进行活化,结果显示只有当pH低于4.5才能得到成熟有活性的重组单峰驼凝乳酶。活化的单峰驼凝乳酶能够凝固新鲜牛乳与双峰驼乳,且凝牛乳的效果好于驼乳,这与驼乳自身的特性有关。重组单峰驼凝乳酶原的活化速率与重组牛凝乳酶原差别很大,单峰驼凝乳酶原活化速率远远低于牛凝乳酶原。调pH至2.0进行酸化,牛凝乳酶原在2h以内完全活化,而单峰驼凝乳酶原需3d以上,当在活化体系中加入NaCl时,能显著提高单峰驼重组酶原的活化速率。将牛凝乳酶原自剪切序列附近的氨基酸(propeptide41-42和chymosin1-6)和牛凝乳酶原以及自剪切序列附近的氨基酸(propeptide1-42和chymosin1-6)取代单峰驼凝乳酶原相应序列,构建到pET30a上,转入大肠杆菌中进行表达与蛋白复性,获得融合蛋白MUT-1和MUT-2。二者经酸化/中和处理,MUT-1在pH2.0-8.5范围内均不能活化,MUT-2的活化情况与单峰驼凝乳酶原相同。这也暗示酶原的激活不仅涉及propeptide与酶活性部位静电作用,还可能与凝乳酶的结构或酶活相关。本研究旨在为重组凝乳酶工业化生产提供高效表达的菌种。已获得的研究结果将为今后这两重组凝乳酶的工业化生产提供一定的实验基础。